Met behulp van Ustilago maydis als een paard van Troje voor In Situ levering van maïs eiwitten

Het onderzoeken van processen op genetische en eiwitniveaus is cruciaal in gewasonderzoek. Onze aanpak maakt inspectie van uitgescheiden doolhofeiwitten met hoogste ruimtelijke temporele resolutie aan verschillende infectiezijden en weefsels mogelijk. De Trojan Horse Methode verkent nuttige automaat secretoire mogelijkheden.

Het omzeilt tijdrovende en uitdagende doolhof transformaties, en vergemakkelijkt gedetailleerde studies over uitgescheiden eiwitten binnen het doolhof appelplatz. Gedetailleerde informatie over de juiste infectie van toegevoegde doolhof bladeren, kwasten en oor. En toont de succesvolle studie van infectieprogressie en eiwitfunctie in het doelweefsel.

Het aantonen van de procedure zal Zijn Isabell Fiedler, een grad student van het laboratorium. Om te beginnen met het experiment, krassen Eumadous van een pediatr plaat met behulp van een steriele pasteur pipet. Inoculate 5 milliliter YEPS Light Medium met Eumadous.

Laat de cultuur groeien op 28 graden Celsius, met constant schudden bij 200 rpm gedurende 16 uur. De volgende dag mix 900 microliters van verse YEPS Light met 100 microliters van de nachtelijke cultuur. Meet de OD-600 met YEPS Light Medium als een blanco in de spectrofotometer analyse.

Verdun de nachtcultuur met verse YEPS Light Medium tot een OD-600 van 2. Laat de cultuur groeien op 28 graden Celsius met constante schudden bij 200 rpm, totdat het bereikt het midden van log groeifase, aangegeven door een OD-600 van 8 tot 1,0. Na incubatie, oogst de cellen door ze te draaien op 3000 keer chi gedurende 10 minuten.

Gooi de supernatant weg. Was vervolgens de celpilette een keer met 1 kweekvolume van DDH2O. Draai de cellen op 3000 time chi gedurende 10 minuten en gooi de supernatant.

Dan, opnieuw op te schorten de cel pilette zorgvuldig in DDH2O, met behulp van een 20 milliliter glazen pipet. Daardoor het aanpassen van de laatste OD-600 TOT 3.0 voor een Trojaans paard test of 1.0 voor ziekte rating. Cultiveren het doolhof planten tot een stadium van volwassen bladeren, waar ten minste blad 7 groeit binnen de stengel.

Breng vervolgens de Eumadous-cultuur over in een 3 milliliter spuit met een 20-meterbiedernaald. Druk voorzichtig op de steel om het spiegelstamweefsel te lokaliseren. De basis van de Mirror Stem kan worden onderscheiden door een overgang van hardere stengel naar zachter weefsel.

Markeer de Mirror Stem op de steel met een pen. Injecteer 1,5 milliliter Eumadous cultuur 1 centimeter boven de Shoot Mirror Stem of Inflorescence Mirror Stem. Zodra de doolhofplanten het kwaststadium bereiken, drukt u voorzichtig op de steel om de kwast in de steel te lokaliseren.

Markeer de punt en de basis van de kwast op de steel met behulp van een pen. Breng de Eumadous cultuur in een 3 milliliter spuit met een 20 gauge bi een hypodermische naald om een totaal van 1,5 milliliter van het entmateriaal rond de kwast te injecteren. Om gelijke verdeling van het entmateriaal te verzekeren, plaats u langzaam 5 milliliter op de punt, het midden en de basis van de kwast die met de pen is gemarkeerd.

Breng de Eumadous cultuur in een 3 milliliter spuit met 20 meter bi een hypodermische naald. Injecteer de inentingsnaald zo diep mogelijk in de ruimte tussen de kafbladeren zonder het oor te verwonden en laat vervolgens 1,5 milliliter van het entmateriaal rond het oor vrij. Verwijder vervolgens de spuit en naald en masseer de kolf zorgvuldig om de Eumadous-oplossing gelijkmatig te verdelen.

Drop 10 microliter van entmateriaal op een PD houtskool vijzelplaat. Dan incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 dagen. Hyphae afscheid ZM Mach1 zijn omgeven door fluorescerende en kersensignaal.

In tegenstelling, niet-krijten hyphae alleen laten zien fluorescerend signaal in de schimmel cytoplasma. Onjuiste kwastlokalisatie of ongelijke verdeling van het entmateriaal kan leiden tot niet-infecteerde kwast of slechts gedeeltelijke infectie van de kwast in vergelijking met zelfs distributie. De solo pathogene Trojan Horse Progenester stam SG-200, gekweekt op PD houtskool vijzel, vormt witte pluis filamenten op de plaat zoals afgebeeld.

Terwijl de Eumadous stam FB1 paring vereist voor infectieuze filamentvorming. Na infectie, de mogelijke reactie van tekenen van de Trojan Horse lever eiwit kan worden geanalyseerd met behulp van verschillende methoden, waaronder ziekte ratings of microscopische beeldvorming. Voor veel ziekteverwekkers zijn transformatie en afscheiding goed begrepen en kunnen ze op een vergelijkbare manier worden verkend.

Daarom maken ze de studie van de gastheer mogelijk, die niet gevoelig zijn voor transformatie.