Name: Candida albicans kullanarak gerçek zamanlı ekstraselüler akı analiz biyo-enerji incelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Öğrenin Candida albicans'ta mitokondriyal solunum ve glikolitik fonksiyonları ekstra flux analizörü ile ölçme yöntemini. Bu teknik, mitokondri saflaştırması yapmadan metabolik süreçleri incelemeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NC laboratuarında Araştırma Ulusal kurumları Sağlık (NIH) grant R01AI24499 ve bir New Jersey Sağlık Vakfı (NJHF) grant, #PC40-18 tarafından desteklenir.

Not: Testin detaylı kademeli Protokolü aşağıda anlatılan ve şematik protokolü şekil 1' de gösterilen.
1. C. albicans suşları ve büyüme koşulları
<ol><li>C. albicans suşları sıvı Maya özü-pepton-dekstroz (YPD) orta 30 °C bir kuluçka shaker gecede büyümek. Not: Candida suşları donmuş hisse senetleri olarak korumak ve YPD agar (% 1 Maya ekstresi, % 2 pepton, %2 dekstroz ve %2 agar) büyümek.</li>
</ol>2. reaktifler hazırlanması
<ol><li>Tahlil Orta şekilde hazırlayın:<ol>
<li>1,04 g Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 tozu ve 2 gr glukoz (% 2) mitokondriyal işlev tahlil için çözmek 90 mL steril su ve sıcak ortam ile 37 ° c PH 5 M NaOH kullanarak 7.4 için ayarlamak ve ses seviyesi açma 100 mL steril su ile yapın.</li>
		<li>Glycolytic stres tahlil için 1,04 g RPMI 1640 toz 90 mL steril su yalnız dağıtılması, 37 ° C ortam sıcak ve pH 7.4 için ayarlayın. Sesini 100 mL steril su ile yapın. RPMI 1640 toz pH değişikliği sırasında tahlil Glikoliz bir ölçüsü olarak izlemek için önemlidir yok bikarbonat vardır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjeksiyon bileşikler.<ol>
<li>Steril su ve mağaza-20 ° C'de 1 M glikoz hisse senedi hazırlamak</li>
		<li>100 mM oligomycin stok Dimetil sülfoksit (DMSO), küçük miktarlar aliquot hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>100 mM antimycin A stok DMSO, küçük miktarlar aliquot hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>100 mM SHAM (salicylhydroxamic asit) stokta etanol tahlil gününde hazır olun.</li>
		<li>Testin gün 1 M KCN steril su hazırlamak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. kaplama tahlil plaka ile Poly-D-lizin (PDL)
Not: tüm yerine aşağıdaki adımları Laminer Hood.
<ol><li>Poly-D 50 µg/mL nihai toplama yapmak için lisin doku kültürü sınıf suda çözülür. İyi ve aliquot bir 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine karıştırın ve uzun vadede-20 ° C'de depolayın. Not: iyi başına 50 µL gereklidir ve 24 kuyular için 1.2 mL gereklidir. Bu nedenle, aliquot en az 1.3 mL microcentrifuge tüp başına.</li>
	<li>İyi ücret 50 µL ekleyin ve 1-2 h için kapalı kapak ile oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Çözüm Aspire edin ve bir kez 500 µL steril doku kültürü sınıf su ile durulayın.</li>
	<li>Kapağı açın ve hava Kuyu kuru izin. Plaka aynı gün veya mağaza 4 ° C'de en fazla 2-3 gün için kullanın.</li>
</ol>4. hidrasyon sensör kartuş
Not: bir gün deneme önce bu adımı gerçekleştirin.
<ol><li>İlave akı tahlil Kit açın ve içeriğini kaldırın. Baş aşağı yanında yardımcı programı plaka (Şekil 2) sensör kartuşu yerleştirin.</li>
	<li>Dolgu her yardımcı programı saçtan calibrant 1 mL ile iyi ve sensör kartuş geri yerleştirin. Fluorophores (oksijen ve pH ölçmek için) içeren sensörler içinde calibrant batık emin olun.</li>
	<li>Sensör kartuşta gecede bir sigara-CO2 kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya</li>
</ol>5. büyüyen ve PDL kaplı plakalar hücrelerde tohumlama
<ol><li>C. albicans YPD et suyu içinde aşılamak ve gecede 200 devirde bir shaker 30 ° C'de büyür. Not: tahlil tasarım ve faiz dayanarak, C. albicans Ayrıca YPG veya en az orta yetiştirilir.</li>
	<li>Tahlil günde 100 µL başına 100.000 hücre son bir konsantrasyon verim için tahlil orta hücrelerde uygun sayıda sulandırmak.</li>
	<li>Tahlil plaka wells A1, B4, C3 ve hangi tahlil orta arka plan düzeltme (şekil 3) için sadece 100 µL eklemek D6 dışında her kuyuya seyreltilmiş hücre 100 µL ekleyin.</li>
	<li>60 dk, plaka yüzeyine bağlı hücreler olanak vermek için kuluçkaya ve sigara-CO2 kuluçka 37 ° C'de plaka transfer.</li>
</ol>6. tahlil Protokolü
Not: Burada özetlenen araç 24-şey biçimi için iletişim kuralıdır. Birimleri başka bir biçimde kullanılırsa ayarlanması gerekir.
<ol><li>Mitokondriyal işlev tahlil<ol>
<li>Bileşikler hazırlanması<ol>
<li>Bileşikleri, 10 x konsantrasyon mitokondriyal işlev tahlil için hazırlamak: 20 mM SHAM, 100 µM hazırlamak Oligomycin, 100 mM KCN ve 20 µM Antimycin A karşılık gelen tahlil orta.</li>
			<li>50 µL SHAM A bağlantı noktası 55 µL içine eklemek Oligomycin bağlantı noktasına B, 62 µL C ve bağlantı noktasına KCN 68 µL Antimycin A D bağlantı (şekil 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Glycolytic stres tahlil<ol>
<li>Bileşikler hazırlanması<ol>
<li>Bileşikleri, 10 x konsantrasyon glycolytic stres tahlil için hazırlayın. 100 mM glikoz, 100 µM hazırlamak Oligomycin, 500 mM 2-Deoksi glikoz (2DG) ve 20 µM Antimycin A karşılık gelen tahlil orta.</li>
			<li>Bağlantı noktası A, 55 µL 50 µL glikoz Ekle Oligomycin bağlantı noktasına B, 62 µL 2-DG bağlantı noktasına C ve 68 µL Antimycin A bağlantı noktasına ö.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hangi oksijen tüketim oranını (OCR) ve ekstraselüler asitleştirme oranı (D.H.T.) 24-şey plaka kartvizitlere canlı hücrelerin ilave akı Analyzer'ı kullanır. Tahlil Protokolü önceden ayarlayın.</li>
	<li>İlave akı Analyzer'ı açın ve tahlil Sihirbazı sekmesini kullanarak tahlil şablon ayarlama ve kurulum sırasında pops dışarı tüm bilgileri doldurmak için adım adım talimat izleyin. Grup düzeni benzer olarak şekil 5' te gösterilen oluşturur. Protokolü Tablo 1' de gösterildiği gibi ayarlayın. Bu düzenleri önde önce tahlil ayarlayın ve bilgisayara kaydedin. Tahlil zaman kaydedilmiş Protokolü tahlil Sihirbazı sekmesinde (şekil 5) dosyasını açın seçeneğine karşılık gelen dosya açarak geri yükleyin.</li>
	<li>Calibrant içeren sulu sensör kartuş ilgili bağlantı noktalarından 10 x bileşikler yük ve ilave akı analyzer taşıyıcı tepsisine yükleyin. Kalibrasyon ekranda Start düğmesine basarak başlatın.</li>
	<li>Tahlil orta 350 µL yavaşça hücre plakasına son hacim 450 µL getirmek için hücre rahatsızlık en aza indirmek için kuyu tarafındaki ekleyin.</li>
	<li>Calibrant tahlil plakalı içeren yeni plaka değiştirmek ve devam edin.</li>
	<li>Bir kez tahlil tam sensör kartuş ve plaka çıkarın. Dosyayı uygun hedef klasöre kaydedin.</li>
</ol>7. veri analizi
<ol><li>Eğri - Varyans analizi (AUC-ANOVA) analiz sekmesi yazılım alanında ilgili parametre (OCR veya D.H.T.) şekil 6' da gösterildiği gibi seçerek gruplar arasında anlamlı bir fark hesaplamak için kullanın.</li>
	<li>Karşılaştırılacak grupları seçin.</li>
	<li>İçin ANOVA analizi gruplara ekleyin ve Tamam' ı tıklatın. Not: Bu AUC ANOVA analizi hangi AUC her grup için hesaplanan ve ANOVA tarafından aralarında karşılaştırıldığında dosya yeni bir sayfa ekler. Bu önemini göstermek için p değerlerinin bir tablosu verecektir.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+killers%3A+human+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hidden killers: human fungal infections.</a> Science Translational Medicine. 4 (165), (2012).</li>
<li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+US+hospitals%3A+analysis+of+24%2C179+cases+from+a+prospective+nationwide+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study.</a> Clinical Infectious Diseases. 39 (3), 309-317 (2004).</li>
<li>Ascioglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+opportunistic+invasive+fungal+infections+in+immunocompromised+patients+with+cancer+and+hematopoietic+stem+cell+transplants%3A+an+international+consensus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international consensus.</a> Clinical Infectious Diseases. 34 (1), 7-14 (2002).</li>
<li>Stover, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+infection+rates+in+US+children%27s+hospitals%27+neonatal+and+pediatric+intensive+care+units%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Infection+Control%22%5BJournal%5D)">Nosocomial infection rates in US children's hospitals' neonatal and pediatric intensive care units.</a> American Journal of Infection Control. 29 (3), 152-157 (2001).</li>
<li>Wilson, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direct+cost+and+incidence+of+systemic+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Value+in+Health%22%5BJournal%5D)">The direct cost and incidence of systemic fungal infections.</a> Value in Health. 5 (1), 26-34 (2002).</li>
<li>Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+candidemia%3A+risk+factors+and+attributable+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Nosocomial candidemia: risk factors and attributable mortality.</a> Clinical Infectious Diseases. 20 (6), 1531-1534 (1995).</li>
<li>Wisplinghoff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+pediatric+patients+in+United+States+hospitals%3A+epidemiology%2C+clinical+features+and+susceptibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in pediatric patients in United States hospitals: epidemiology, clinical features and susceptibilities.</a> Pediatric Infectious Disease Journal. 22 (8), 686-691 (2003).</li>
<li>Cheng, W. C., Leach, K. M., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+death+pathways+in+yeast+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial death pathways in yeast and mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (7), 1272-1279 (2008).</li>
<li>Shingu-Vazquez, M., Traven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+fungal+pathogenesis%3A+drug+tolerance%2C+virulence%2C+and+potential+for+antifungal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and fungal pathogenesis: drug tolerance, virulence, and potential for antifungal therapy.</a> Eukaryotic Cell. 10 (11), 1376-1383 (2011).</li>
<li>Brown, A. J., Brown, G. D., Netea, M. G., Gow, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+impacts+upon+Candida+immunogenicity+and+pathogenicity+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Metabolism impacts upon Candida immunogenicity and pathogenicity at multiple levels.</a> Trends in Microbiology. 22 (11), 614-622 (2014).</li>
<li>Tucey, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+Homeostasis+Is+Important+for+Immune+Cell+Viability+during+Candida+Challenge+and+Host+Survival+of+Systemic+Fungal+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glucose Homeostasis Is Important for Immune Cell Viability during Candida Challenge and Host Survival of Systemic Fungal Infection.</a> Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).</li>
<li>Barelle, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-specific+regulation+of+central+metabolic+pathways+in+a+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Niche-specific regulation of central metabolic pathways in a fungal pathogen.</a> Cellular Microbiology. 8 (6), 961-971 (2006).</li>
<li>Carman, A. J., Vylkova, S., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+acetyl+coenzyme+A+synthesis+and+breakdown+in+alternative+carbon+source+utilization+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Role of acetyl coenzyme A synthesis and breakdown in alternative carbon source utilization in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 7 (10), 1733-1741 (2008).</li>
<li>Fradin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocytes+govern+the+transcriptional+response%2C+morphology+and+proliferation+of+Candida+albicans+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Granulocytes govern the transcriptional response, morphology and proliferation of Candida albicans in human blood.</a> Molecular Microbiology. 56 (2), 397-415 (2005).</li>
<li>Lorenz, M. C., Bender, J. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+response+of+Candida+albicans+upon+internalization+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional response of Candida albicans upon internalization by macrophages.</a> Eukaryotic Cell. 3 (5), 1076-1087 (2004).</li>
<li>Ramirez, M. A., Lorenz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+alternative+carbon+utilization+pathways+in+Candida+albicans+attenuate+virulence+and+confer+pleiotropic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mutations in alternative carbon utilization pathways in Candida albicans attenuate virulence and confer pleiotropic phenotypes.</a> Eukaryotic Cell. 6 (2), 280-290 (2007).</li>
<li>Bambach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goa1p+of+Candida+albicans+localizes+to+the+mitochondria+during+stress+and+is+required+for+mitochondrial+function+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Goa1p of Candida albicans localizes to the mitochondria during stress and is required for mitochondrial function and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 8 (11), 1706-1720 (2009).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dysfunction+of+mitochondrial+complex+I+of+the+Candida+albicans+goa1+mutant+is+associated+with+increased+reactive+oxidants+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dysfunction of mitochondrial complex I of the Candida albicans goa1 mutant is associated with increased reactive oxidants and cell death.</a> Eukaryotic Cell. 10 (5), 672-682 (2011).</li>
<li>Desai, C., Mavrianos, J., Chauhan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+SRR1%2C+a+putative+two-component+response+regulator+gene%2C+is+required+for+stress+adaptation%2C+morphogenesis%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Candida albicans SRR1, a putative two-component response regulator gene, is required for stress adaptation, morphogenesis, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 10 (10), 1370-1374 (2011).</li>
<li>Mavrianos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+two-component+signaling+systems+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial two-component signaling systems in Candida albicans.</a> Eukaryotic Cell. 12 (6), 913-922 (2013).</li>
<li>Koch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondrial+GTPase+Gem1+Contributes+to+the+Cell+Wall+Stress+Response+and+Invasive+Growth+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Mitochondrial GTPase Gem1 Contributes to the Cell Wall Stress Response and Invasive Growth of Candida albicans.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2555(2017).</li>
<li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+sorting+and+assembly+machinery+subunit+Sam37+in+Candida+albicans%3A+insight+into+the+roles+of+mitochondria+in+fitness%2C+cell+wall+integrity%2C+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial sorting and assembly machinery subunit Sam37 in Candida albicans: insight into the roles of mitochondria in fitness, cell wall integrity, and virulence.</a> Eukaryotic Cell. 11 (4), 532-544 (2012).</li>
<li>Brandt, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrandt%2C+ME+%22Candida+and+Candidiasis%22">Candida and Candidiasis</a>. , American Society for Microbiology Press. book review (2002).</li>
<li>Huh, W. K., Kang, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+functional+expression+of+alternative+oxidase+from+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and functional expression of alternative oxidase from Candida albicans.</a> Journal of Bacteriology. 181 (13), 4098-4102 (1999).</li>
<li>Yan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+oxidase+of+Candida+albicans+causes+reduced+fluconazole+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">The alternative oxidase of Candida albicans causes reduced fluconazole susceptibility.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (4), 764-773 (2009).</li>
<li>de Moura, M. B., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+intact+mammalian+cells+using+the+Seahorse+XF24+Extracellular+Flux+analyzer+and+a+luciferase+ATP+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of intact mammalian cells using the Seahorse XF24 Extracellular Flux analyzer and a luciferase ATP assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1105, 589-602 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Bioenergetics mitokondriyal işlev oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) ölçerek okumak için mükemmel bir araç olarak hizmet veren ilave akı tahlil-bağımlı oksijen tüketimi içinde gerçek-zaman. Buna ek olarak, bir hücre dışı asitleştirme oranı (ekstrasellüler pH değişikliği) olarak ölçülen glycolytic bir fonksiyonu da aynı anda gerçek zamanlı analiz soruşturma olmaktır.
PDL kaplamalı plakalar hücrelerde kuluçka izin verdiğinden tahlil plakasına uygun hücrelere C. albicans başarılı kaplama t...

İnvazif mantar enfeksiyonları yılda dünya çapında 1,5 milyonun üzerinde kişi öldür. Yaşlı, prematüre bebeklerde, organ nakli alıcılar ve kanser hastaları1de dahil olmak üzere tehlikeye dokunulmazlık ile yaşayan insanların sayısında bir artış nedeniyle yükselişte sayıdır. C. albicans insan mikrofloranın parçasıdır fırsatçı bir insan mantar patojen var. Bu da Mukozal yüzeyler ve gastrointestinal sistem komensal bir organizma olarak yaşıyor. C. albicans bağışıklık eksiklikler, kim cerrahi undergone ya da kim uzun kursları antibiyotik ile tedavi edilmiş olan kişilerde ciddi sistemik hastalık üretir. Candida türleri sırası Nozokomiyal enfeksiyon hastalıkları (NID) insanlar2,3,4,5,6,7ilk üç-dört nedenleri arasında. Candida kan dolaşımına enfeksiyonların yıllık genel sayısı ~ 400.000 talepleriyle ilişkili Scotlan 46-%751olduğu tahmin edilmektedir. Kandidiyazis nedeniyle yıllık mortalite yaklaşık 10.000 ABD tek başına olduğunu. NID mantarlar tarafından neden olduğu ölçüde astronomik hasta giderleri5' da yansıtılır. Amerika Birleşik Devletleri'nde, yıllık masraf invazif mantar enfeksiyonları tedavisi için $2 milyar, zaten aşırı yüklenmiş sağlık sistemi için çok büyük bir yük ekleyerek aşan. Şu anda, mevcut standart antifungal tedavilerin toksisite, giderek yaygın ilaç direnci ve ilaç-ilaç etkileşimleri nedeniyle sınırlıdır. Bu nedenle, yüksek riskli hastalar için daha iyi tedavi seçenekleri neden olur yeni antifungal ilaç hedefler belirlemek için acil bir ihtiyaç vardır. Ancak, yeni ilaçlar mantar hedef üstünde hareket keşfi mantarlar ökaryotlarda olduğundan karmaşıktır. Bu büyük ölçüde özel mantar uyuşturucu hedef sayısını sınırlar.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda mitokondri hücresel solunum, oksidatif metabolizma, sinyal iletimi ve apoptosis8 için önemli olduğundan mitokondri mantar virülans için önemli bir katkı ve antifungal ilaçlar için hoşgörü olduğunu belirttiler ,9,10,11. Glycolytic ve glycolytic metabolizma C. albicans hayatta memeli ev sahibi12,13,14,15,16için önemlidir. Ayrıca, birkaç C. albicans mutantlar mitokondrial proteinler, Goa1 gibi eksik Srr1, Gem1, Sam37 vb filamentation, bir önemli virülans faktörü C. albicans17, arızalı olduğu gösterilmiştir 18 , 19 , 20 , 21 , 22. buna ek olarak, bu mutant Ayrıca, bir fare modeli virülans kandidiyazis17,18,19,20,21 Dissemine için zayıflatılmış gösterildi ,22. Böylece, mantar mitokondri ilaç keşfi için cazip bir hedef gösterir. C. albicans mitokondrial genom yaşayamaz anlamına gelir petite negatif23, çünkü ancak, C. albicans mitokondriyal işlevde çalışmanın meydan okuyor.
Burada, biz C. albicans mitokondrial ve glycolytic işlevinde mitokondri arındırmak için gerek kalmadan araştırmak için kullanılan bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu yöntem aynı zamanda genetik manipülasyon veya kimyasal modülatörler C. albicansmitokondrial ve glycolytic yollar üzerindeki etkisini araştırmak için optimize edilebilir.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>MT50020PB</td><td></td></tr><tr><td>Antimisin A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mito stres kiti</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td></td></tr><tr><td>Oligomisin</td><td>Calbiochem</td><td>495455</td><td></td></tr><tr><td>pH metre</td><td>Accumet</td><td>AR20</td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızı</td><td>Sigma</td><td>P5530</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D lizin</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Santa cruz</td><td>203242</td><td></td></tr><tr><td>Denizatı XF24 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>SHAM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Amresco&nbsp;</td><td>241</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit peletleri</td><td>JT Baker</td><td>3722</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü sınıfı su</td><td>Gibco</td><td>1523-0147</td><td></td></tr><tr><td>XF tahlil kalibran çözeltisi</td><td>Agilent</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü Pepton Dekstroz</td><td>Fisher scientific,</td> <td>BP2469</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü Pepton Dekstroz Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü Pepton Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr></tbody></table>

candida albicans kullanarak gerçek zamanlı ekstraselüler akı analiz biyo-enerji incelenmesi

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Mitokondri temel organellerin hücre metabolizması ve hayatta kalmak için vardır. Önemli olaylar çeşitli hücresel solunum, oksidatif metabolizma, sinyal iletimi ve Apoptozis gibi mitokondri içinde yer alır. Sonuç olarak, mitokondrial disfonksiyon antifungal ilaç hoşgörü ve patojenik mantar virülans önemli bir rol oynamaya bildirilmektedir. Son veri mitokondri önemini mantar patogenezinde önemli bir katkı olarak tanınması da açmıştır. Mitokondri mantar Biyolojide önemini rağmen onun işlevini anlamak için standartlaştırılmış yöntemler kötü geliştirilir. Burada, çalışma Bazal oksijen tüketim oranını (OCR), bir ölçü mitokondrial solunum ve ekstraselüler asitleştirme oranları (D.H.T.), C. albicans suşları glycolytic işlevinde bir ölçü için bir yordam mevcut. Burada açıklanan yöntemi herhangi bir soy Candidaspp. mitokondri sağlam mantar hücrelerden arındırmak için gerek kalmadan uygulanabilir. Ayrıca, bu iletişim kuralı Ayrıca özelleştirilebilir için C. albicans suşları mitokondriyal işlevde inhibitörleri ekran.

C. albicans ilave akı Çözümleyicisi tarafından değerlendirildi biyo-enerjetik işlevlerini belirlemek için bu iletişim kuralını odak noktasıdır. Mitokondrial protein Mam33 eksik bir C. albicans mutant Ayrıca onun tamamlayıcı zorlanma, mitokondriyal bir protein silme etkilerini OCR ve D.H.T. çalışmaya mam33Δ/Δ::MAM33 ile birlikte bulunur. MAM33 için sözde mitokondrial asidik matris protein kodlar ve Candida onun işlevinde bilinen değil.
<p cl...

Burada, mitokondrial solunum ve Candida Albicans glycolytic işlevinde araştırmak için kademeli bir protokol bir ilave akı çözümleyicisini kullanarak mevcut.

Candida albicans kullanarak gerçek zamanlı ekstraselüler akı analiz biyo-enerji incelenmesi

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Bu protokol Candida albicans glikolitik fonksiyon ve mitokondriyal solunum belirlenmesi için önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, mitokondriyal fonksiyonun Candida albicans'dan mitokondriyi arındırmaya gerek kalmadan ölçülmesine olanak sağlamasıdır. Bu yöntem, candida albicans veya diğer mantar patojenlerinde mitokondriyal ve glikolitik yollar üzerinde genetik manipülasyon veya kimyasal modülatörlerin etkilerini araştırmak için optimize edilebilir.Bu teknik nispeten basittir. Ya da organizmaya bağlı olarak, onların kullanımı hücre numarasını ve onların tsay mitokondriyal inhibitörlerin konsantrasyonu optimize etmek için yardımcı olabilir. Bir laminar akış kaputunda, doku ızgara susında ki Poli-D-Lizin'i mililitre başına 50 mikrogramlık son konsantrasyona eritin.Çözeltiyi iyice karıştırın ve 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplere yerleştirin ve tüp başına en az 1,3 mililitre aliquot olmasını unutmayın. Bu karışımın 50 mikrolitresini her bir kuyuya tazyik plakasının her kuyusuna ekleyin, kapağı kapatın ve oda sıcaklığında 1-2 saat kuluçkaya yatırın. Sonra çözelti aspire.500 mikrolitre steril doku kültürü sınıfı su ile bir kez yüzer, kapağı açın ve kuyuların kurumasını bekleyin. Plakayı hazırlandığı gün kullanmıyorsanız, en fazla iki ila üç gün süreyle dört derece saklayın. Denemeden bir gün önce, ekstra akı temizleme kitini açın ve içeriğini çıkarın.Sensör kartuşu yardımcı plakanın yanına ters yerleştirin. Yardımcı plakanın her kuyusunu bir mililitre kalibrrant ile doldurun ve sensör kartuşu geri yerleştirin. Florofor içeren sensörlerin kalibreğe batırDığından emin olun.Sensör kartuşu bir gecede karbondioksit olmayan bir kuluçka makinesinde 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Bir gün önce, YPD suyu hazırlanan C albicans aşılamak ve 200 rpm bir shaker 30 derece santigrat gecede büyümek. Tahlil günü, 100 mikrolitre başına 100, 000 hücre nihai konsantrasyon verim tahlil orta hücrelerin uygun sayıda seyreltmek.A1, B4, C3 ve D6 kuyuları dışında, sulandırılmış hücrelerin her bir kuyuya 100 mikrolitre sini ekleyin. Bu kuyular için, arka plan düzeltme için sadece 100 mikrolitre araştırma ortamı ekleyin. Hücreleri plaka yüzeyine yapışmasını sağlamak için 60 dakika boyunca karbondioksit olmayan bir kuluçka makinesinde 37 santigrat derecede plaka kuluçka. Metin protokolünde belirtildiği gibi karşılık gelen test orta 10X konsantrasyonda mitokondriyal fonksiyon tsay için bileşikler hazırlayın.A limanına 50 mikrolitre SHAM, B limanına 50 mikrolitre Oligomisin, C limanına 62 mikrolitre potasyum siyanür ve 68 mikrolitre Antimisin A'yı port D.Next'e ekleyin, metprotokolde belirtildiği gibi ilgili test te 10X konsantrasyonunda glikolitik stres analizi için bileşikleri hazırlayın. A limanına 50 mikrolitre glikoz, B limanına 55 mikrolitre Oligomisin, C limanına 62 mikrolitre 2-DG ve 68 mikrolitre Antimisin A'yı port D.Before porta ekleyin, ekstra akı analizörü açın ve tahmin sihirbazı sekmesini kullanarak analiz şablonu ayarlayın. Adım adım yönergeleri izleyin ve kurulum sırasında ortaya çıkan tüm bilgileri doldurun.Bir grup düzeni oluşturun ve metin protokolünde belirtildiği gibi protokolü ayarlayın. Bu düzenleri tramadan önce kaydedin. Tarama sırasında, ilgili dosyayı test sihirbazı sekmesinde açık dosya seçeneğinde açarak kaydedilen protokolü geri yükleyin.Daha sonra 10X bileşikleri, kalibrant içeren sulu sensör kartuşu ilgili portlarına yükleyin. Sensör kartuşunu ekstra akı analizörünün taşıyıcı tepsisine yükleyin. Ekrandaki başlat düğmesine tıklayarak kalibrasyonu başlatın.Daha sonra, son hacmi 450 mikrolitreye çıkaran hücre bozulmasını en aza indirmek için duvarların yan tarafındaki hücre plakasına 350 mikrolitre tahlil ortamı ekleyin. Kalibrant içeren yardımcı plakayı, kalıtım plakası ile değiştirin ve taramaya devam edin. Tsama tamamlandıktan sonra sensör kartuşu ve plakayı çıkarın.Dosyayı uygun hedef klasörüne kaydedin. Bu çalışmada, C albicans biyo-enerjik fonksiyonları ekstra akı analizörü tarafından değerlendirilir. Mitokondriyal protein mam33'ten yoksun bir mutant, mitokondriyal proteinin oksijen tüketimi ve hücre dışı asitleşme oranları üzerindeki etkilerini incelemek için tamamlayıcı suşuyla birlikte dahildir.C albicans yabani türü herhangi bir ekstrasellüler akı tsay için en uygun aralık içinde de dakikada 145 pikomoles bir oksijen tüketim oranı gösterir. Yabani tip, mam33 mutant ve mam33 tamamlayıcı suşları bazal oksijen tüketim oranı hiçbir fark göstermektedir. Benzer şekilde, suşlar arasında bazal ekstrasellüler asitleşme oranlarında anlamlı bir fark görülmez.Ancak, potasyum siyanür ile kompleks-IV inhibe ederek, yabani tip ve mam33 mutant, mam33 tamamlayıcı suşları glikolizine doğru önemli bir kayma göstermektedir. Mam33 mutant suşu ancak bileşik-IV bağımlı yolu bu zorlanma bozulmuş olduğunu düşündüren bir telafi glikolitik değişim göstermek için başarısız oldu. Glikolitik stres testinde hücreler bir saat boyunca glikozdan yoksun kalınır ve bazal oksijen tüketim hızı ve ekstrasellüler asitleşme oranı ölçülür.Açlık üzerine, mam33 mutant suşu diğer suşlara göre önemli ölçüde daha düşük oksijen tüketimi ve ekstrasellüler asitleşme oranları göstermektedir. Bu hücreler açlık durumuna zorlandığında hem solunum hem de glikoliz için glikoz kullanımının bozulduğunu düşündürmektedir. Glikoz enjekte ettikten sonra, tüm suşlar hem oksijen tüketim hızı hem de hücre dışı asitleşme oranının uyarılmasını gösterir.Asay makinasının kaplaması, Candida albicans hücrelerinin plakaya yapışmasını sağlar. Candida albicans hücrelerinin uygunsuz yapışması, sonuç sonucunu etkileyecektir. Bu tekniğin geliştirilmesinden sonra, fizyolojik ve patolojik durumlarda mitokondrinin nasıl işlediğini ele alan çok çeşitli hücre tipleri ve hastalıklarında kullanılmaktadır.Örneğin, bu testte hasta kaynaklı ve kontrol hücreleri istihdam, mitokondriyal fonksiyonun nasıl değiştirildiğine ilgili belirli soruları ele almak mümkündür. Bu bileşikler son derece zehirli olduğu için potasyum siyanür ve antimisin A gibi mitokondriyal inhibitörleri hazırlanırken dikkatli olunmalıdır.

bio-energetics-investigation-candida-albicans-using-real-time

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu protokol, hücre dışı akı testi ile primer lösemik hücrelerin hücre dışı asitlenme oranını (ECAR) ve oksijen tüketim oranını (OCR) ölçmek için biyokimyasal bir yaklaşım sağlar. Bu hücrelerin metabolik profilinin değerlendirilmesi, taleplerinin karakterize edilmesine yardımcı olarak kişiselleştirilmiş tedaviye yol açar.

Hücre Dışı Akı Deneyi: Hücrelerin Metabolik Profilini Ölçmek İçin Bir Yöntem

Bu video, hücre dışı akı analizörü kullanarak aktive edilmiş insan NK hücrelerinde enerji metabolizmasını analiz etme yöntemini göstermektedir. Elektron taşıma zinciri komplekslerinin farklı inhibitörleri, oksijen tüketim oranı veya OCR ile ölçülen ATP sentezini etkiler ve hücresel metabolizma ve biyoenerjetik hakkında bilgi sağlar.

Hücre dışı akı analizörü kullanılarak insan NK hücrelerinde enerji metabolizmasının gerçek zamanlı izlenmesi

Bu teknik oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları explanted fare Retina dokularında bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak gerçek zamanlı kayıt açıklar.

Explanted Retina doku hücre dışı akı analizi ile enerji metabolizmasında ölçümü

Burada sunulan yöntem, HSPC'lerin hücre dışı asitlenme hızını (ECAR) ve oksijen tüketim hızını (OCR) gerçek zamanlı olarak ölçmek için hücre dışı akı analizörünü kullanarak yapışkan olmayan fare hematopoetik kök ve ilkel progenitör hücrelerinde (HSPC'ler) hücresel biyoenerjetik değerlendirme için optimize edilmiş protokolleri özetlemektedir.

Hücre Dışı Akı Analizörü Kullanılarak Fare Hematopoetik Kök ve İlkel Progenitör Hücrelerinde Hücresel Biyoenerjetik Verilerin Değerlendirilmesi

Gerçek zamanlı hücre metabolik akısı testi, pH ve oksijen sensörlerini kullanarak mitokondriyal ve glikolitik adenozin trifosfat üretimine karşılık gelen oksijen tüketim oranını ve hücre dışı asitleşme oranını ölçer. Bu yazıda osteoblastların enerji durumunu ve hücresel biyoenerjetik durumun karakterizasyonu ve yorumlanmasını anlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Bu protokoller, kullanıcıların Denizatı hücre dışı akı analizini kullanarak 3D kanser hücre hattı kaynaklı sferoidlerde mitokondriyal enerji metabolizmasını araştırmalarına yardımcı olacaktır.

Hücre Dışı Akı Analizi Kullanarak Tek 3D Mikrodoku Sferoidlerinin Mitokondriyal Enerji Metabolizmasını Keşfetmek

Metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin ve HL60 hücrelerinin mitokondriyal solunumunu ölçen kademeli protokolleri açıklıyoruz.

Nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü

Alkol kötüye kullanımı, baskılanmış mitokondriyal solunum ve biyoenerjetik nedeniyle alveoler makrofaj () bağışıklığını bozar. Yakın zamanda etanol (EtOH) maruziyetinin'lerde mitokondriyal solunum için glutamin bağımlılığını artırdığını gösterdik. Burada, hücre dışı akı biyoanalizörü kullanılarak EtOH ile tedavi edilen'lerde mitokondriyal solunum için glutamin kullanımını belirlemek için yöntemler sağlanmaktadır.

Hücre Dışı Akı Biyoanalizörü Kullanılarak Kronik Etanole Maruz Kalan Alveolar Makrofajlar için Yakıt Kaynağı Olarak Glutaminin Değerlendirilmesi

Burada, kemik iliği, dalak ve enfarktüslü kalpten makrofajların çıkarılması ve ardından canlı hücrelerdeki metabolik akışın değerlendirilmesi için yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Bu protokol, Saccharomyces eubayanus'ta transkripsiyonel aktivite ölçümlerine izin vererek, glikozdan maltoza geçişi izlemek, metabolik adaptasyonların gerçek zamanlı analizini sağlamak ve çeşitli koşullar altında endüstriyel fermantasyon için gerinim optimizasyonunu desteklemek için bir biyolüminesan raportör kullanır.

In vivo (İn canlı) Mayada Biyolüminesan Raportör Kullanılarak Metabolik Geçiş Sırasında Transkripsiyonel Aktivitenin İzlenmesi

Bu protokol, birincil fare mikrogliasında metabolik yeniden programlamayı niceliklendirmek için glikoliz stres testi yapmanın maliyet etkin bir yolunu tanımlar. İzolasyon ve inflamatuar uyarımdan sonra, taze hazırlanmış, pH-ayarlanmış reaktiflerle hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) ölçülür, ardından protein normalizasyonu uygulanarak glikolitik değişimlerin doğru ve tekrarlanabilir değerlendirilmesini sağlar.

Birincil mikrogliada glikolizin ekstraselüler akı testi kullanılarak araştırılması

Öğrenin Candida albicans'ta mitokondriyal solunum ve glikolitik fonksiyonları ekstra flux analizörü ile ölçme yöntemini. Bu teknik, mitokondri saflaştırması yapmadan metabolik süreçleri incelemeyi kolaylaştırır.

Candida albicans kullanarak gerçek zamanlı ekstraselüler akı analiz biyo-enerji incelenmesi

Daha fazla video keşfet