体外检测评估神仙体头三个月滋养细胞细胞系的迁移、入侵和增殖

这些方法可用于确定影响成虫病入侵的因素，这些因素可能提供对主要不良产科结果的洞察。该技术的优点是，它提供了可能影响成虫细胞入侵（包括增殖和迁移）的几个因素的视觉和定量分析。要开始划痕测定，将适当数量的细胞播种到24井板中，在48小时内达到100%的汇合。

第二天，将介质更改为酚红色自由介质，辅以热灭活炭脱衣FBS。在划痕当天，将所需的治疗添加到每个井的介质中，以预处理细胞30分钟。要创建均匀的伤口，请将无菌 10 微升移液器尖端放在伤口制造商工具的销上。

将刀尖放入第一排井中，沿伤口制造商的轨道移动板，直到移液器尖端到达油井的另一侧。然后将板移回起始位置，以确保在井的直径上不断缠绕。将尖端放入下一排油井中，然后重复，直到所有油井都刮伤。

在显微镜下观察板材，确认划痕覆盖了井的宽度。接下来，小心吸气介质，用1x PBS轻轻清洗两次细胞。最后洗涤后，添加补充的酚红色无剥离或低FBS介质与所需的治疗。

接下来，将带划痕孔的板放在自动延时成像器中，该图像器中含有 37 摄氏度的温度和 95% 湿度的 95% 湿度环境中的 5% 二氧化碳。根据需要定期对细胞进行成像，以便细胞完成伤口愈合。开始入侵测定，在95%湿度的大气中保持37摄氏度的温度和5%的二氧化碳的培养箱中，将适当数量的细胞播种到六孔板中。

允许细胞在48小时内达到90%的汇合。第二天，将介质更改为酚红色自由介质，辅以热灭活炭脱衣FBS。将每毫升10毫克的细胞外基瓶放在冰箱的冰上，让一夜之间解冻。

后天，使用冷冻移液器提示，用酚红色自由血清基质稀释每毫升10毫克的细胞外基质，最终浓度为每毫升5毫克。然后将稀释的细胞外基质的100毫升加入冷藏的24井板中。在37摄氏度下孵育板，使基质变硬。

要为入侵测定准备细胞，请用1毫升1x PBS清洗细胞。然后吸气PBS，并添加500微升1倍的尝试素EDTA到每一个井。将六井板放在培养箱中，在95%的湿度环境中保持37摄氏度的温度和5%的二氧化碳，直到所有细胞都从板底分离。

一旦细胞分离，加入500微升的酚红色自由血清无素介质到每一个井的三辛化细胞。然后将1000微升分离细胞转移到微离心管中，在4摄氏度下以400倍g下旋转5分钟。接下来，吸气介质，重新暂停苯酚红色自由血清基中的细胞。

使用自动细胞计数器计算细胞，并调整细胞悬浮量，最终浓度为每毫升 0.5 百万细胞。在 24 井板的每个井中加入 600 微升的完整生长介质，并将预涂层刀片放入其中。然后在每个预涂层细胞插入物上添加200微升细胞，总共10万个细胞。

将24井板放在培养箱中，在95%的湿度环境中保持37摄氏度的温度和5%的二氧化碳，24小时。经过夜间孵育后，从上腔和下腔中吸入剩余的介质，而不会干扰细胞外基质。然后用棉签小心地从刀片的上部取出细胞外基质和非侵入细胞。

将 1x PBS 添加到井的上部和下腔，将每个刀片洗涤三次。每次洗涤后吸气 PBS。要修复连接到刀片的细胞，请将插入物放入 100%冰冷甲醇中，在 4 摄氏度下放置 30 分钟。

用 1x PBS 清洗刀片三次，并在最后洗涤后取出 PBS。用0.2%水晶紫罗兰在20%乙醇中染色附着在刀片上的细胞10分钟。用去水冲洗三次，最后洗涤后吸气脱水水。

空气干燥插件在室温下一小时。最后，使用钳子和剃刀刀片，小心地切割刀片的底部膜，并将其安装在玻璃滑梯上，底部朝上。使用具有 20 倍目标的光学显微镜，每个样本至少获得四个入侵细胞的独特图像。

要开始增殖检测，请使用自动细胞计数器从烧瓶中计数多头细胞。在标准生长介质中，以每孔0.20万个细胞的密度将细胞播种到六孔板中。然后将细胞放在培养箱中，在95%的湿度大气中保持37摄氏度的温度和5%的二氧化碳，维持4个小时，或直到细胞粘附。

接下来，将介质更改为酚红色无源介质，辅以热灭活炭脱精脱衣 FBS 和所需处理。将六井板放在培养箱中，在95%的湿度环境中保持37摄氏度的温度和5%的二氧化碳。然后更换新介质，每 48 小时辅以所需的治疗。

经过24、48或72小时的治疗，用1毫升PBS清洗细胞，并在每井中加入500微升的三辛EDTA。在培养箱中放置一个六井板，直到细胞与板分离。一旦细胞从板分离，加入500微升的补充剂酚红色自由介质，以停用尝试性。

最后在单独的管子中将五微升的三辛化细胞加入 Trypan Blue 的五微升中，然后通过移液混合。使用自动单元格计数器对重复的每个井中的单元格进行计数。不朽的人类前三个月成河天鹅。

71个细胞在零、8和18小时内用车辆1x PBS或100微摩尔的合成糖皮质激素二甲酮在划痕测定中治疗。测量天鹅的伤口大小和伤口密度。71 和 HTR-8/SVneo 细胞用车辆或 100 纳米摩尔 dex 治疗表明，dex 治疗降低了伤口闭合率，表明糖皮质激素可以抑制细胞迁移。

入侵测定后，糖皮质激素治疗降低了细胞侵入性，如入侵天鹅数量减少15%。。71 和 HTR-8/SVneo 细胞与车辆处理的细胞相比，用 100 纳米摩尔 dex 处理 24 小时。在细胞增殖分析后，糖皮质激素治疗减少了细胞增殖，如天鹅较少所示。

71 和 HTR-8/SVneo 细胞处理 100 纳米摩尔 dex 与车辆处理的细胞相比。评估细胞死亡的方法可以与本程序结合使用，以确定凋亡或坏死是否有助于改变成虫细胞功能。我们独特地采用了癌症生物学中常用的标准技术来研究成虫细胞功能。

没有与这些方法相关的危险。观众唯一应该采取的预防措施是使用无菌技术进行组织培养。