경도 형태 및 생리 적인 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 3 차원 종양 Spheroids의 모니터링

3차원 종양 스페로이드는 생체 내에서 종양의 조직 별 특성을 모방할 수 있으며, 간단한 2D 세포 배양보다 항암 약물 발견을 위한 임상적으로 관련된 데이터를 제공할 수 있습니다. 우리의 이미징 기술, 광학 일관성 단층 촬영, 쉽게 수백 미크론의 크기와 단일 종양 신경의 3D 구조를 시각화 할 수 있습니다, 종종 몇 초 이내에, 그 형태와 작업 감염의 보다 정확한 특성을 제공 할 수 있습니다. 3D 구형 모델을 사용하면 잠재적으로 약물 발견 일정을 단축하고 비용을 절감하며 환자에게 신약을 보다 효과적으로 가져올 수 있습니다.

종양 클러스터의 구형 모양을 형성하는 것은 우리의 실험에 있는 1개의 중요한 단계입니다. 둥근 바닥과 적절한 원심 분리 속도와 함께 오른쪽 초저 부착 플레이트를 선택하는 것이 중요합니다. 원고에 설명된 바와 같이 배양 플라스크에서 흥미로운 세포를 성장시킴으로써 이 실험을 시작합니다.

표준 조건하에서 인큐베이터에서 세포를 유지하고 매일 건강 상태를 모니터링합니다. 필요에 따라 미디어를 새로 고칩니다. 다중 웰 플레이트에서 3D 세포 배양을 수행하기 위해 먼저 세포 배양 플라스크에서 배지를 제거하고 멸균된 33도 의 미리 따뜻하게 된 PBS로 세포를 세척한다.

그런 다음 트립신-EDTA의 밀리리터 1밀리리터를 추가하여 세포를 다시 중단하고 섭씨 37도에서 3분 동안 배양합니다. 트립신을 희석하기 위해 배양 배지의 3 밀리리터를 추가합니다. 이 셀 서스펜션을 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리기를 500G및 실온에서 5분간 이송합니다.

그런 다음 상체를 제거하고 전동 배양 배지의 4 밀리리터로 세포 펠릿을 다시 분리합니다. 세포 농도를 결정하기 위해, 혈종계에 샘플 한 방울을 하이팻하고 세포를 계산합니다. 원하는 시드 농도로 희석합니다.

종자 200 마이크로리터는 매우 낮은 부착, 라운드 바닥 멀티 웰 플레이트의 각 우물에, 밀리리터 당 3, 000 세포의 농도에서, 잘 당 약 600 세포를 달성한다. 시드 직후, 7분 동안 실온에서 사용할 수 있는 가장 낮은 속도로 전체 플레이트를 원심분리합니다. 플레이트를 섭씨 37도, Co2 5%로 배치하여 3일마다 배지를 새로 고칩니다.

먼저, 본 원고의 회로도에 따라 OCT 시스템의 기준 암 및 샘플 암을 구성한다. 그런 다음 킬로미터, 채점, F-테타 렌즈 및 라인 스캔 카메라를 포함하여 분광기를 구성합니다. 플레이트 어댑터를 사용하여 다중 웰 플레이트를 고정 된 위치에 고정된 위치에 놓습니다.

이미징 전에, 2D 틸팅 스테이지를 사용하여 멀티웰 플레이트의 기울기 및 회전을 보정하고, 다른 우물에서 초점 평면의 변화를 최소화하기 위해 전이 단계에 장착된 회전 스테이지를 수정한다. 그런 다음 플레이트의 가장자리가 스테이지 이동 방향과 평행하게 되도록 회전을 조정하여 웰이 OCT 이미지에서 동일한 수평 위치에 유지되도록 합니다. 그런 다음 기울기 스테이지를 조정하여 플레이트가 광학 테이블과 평행하게 유지되도록 하여 웰이 이미징의 동일한 수직 위치에 유지되도록 합니다.

종양 스페로이드 이미징의 날에, 인큐베이터에서 멀티 웰 플레이트를 제거합니다. OCT 이미징 시스템 아래에 전송하여 플레이트 어댑터에 놓습니다. 플레이트의 높이를 조정하려면 번역 단계의 Z 방향을 따라 이동합니다.

사용자 지정 이미징 소프트웨어에서 개발 단계에 따라 전체 종양 스페로이드를 커버하기 위해 원하는 OCT 스캐닝 범위를 설정하고 매개 변수저장을 클릭하여 설정을 저장합니다. 그런 다음 종양 스페로이드의 최적화된 XZ 및 YZ OCT 미리보기를 표시합니다. 스페로이드를 함유한 판의 모든 우물에 대해 종양 스페로이드의 3D OCT 이미지를 하나씩 획득하십시오.

미리 보기 이미지를 보려면 미리 보기 단추를 클릭합니다. 그리고 OCT 이미지를 얻으려면 획득 버튼을 클릭합니다. OCT 데이터 수집의 전체 단계 이동 프로세스를 기록합니다.

모든 종양 스페로이드에 대한 최적의 이미지 품질을 보장하기 위해 플레이트 어댑터를 정확하게 조정해야 하며 중앙값 볼륨은 동일해야 합니다. 사용자 지정 C+처리 코드를 사용하여 종양 스페로이드의 3D OCT 데이터 세트를 처리하여 OCT 구조 이미지를 생성합니다. 스페로이드 의 중심을 가로 질러 세 단면, XY, XZ 및 YZ 평면에 2D OCT 이미지를 사용하여 스페로이드 이미지의 콜라주를 생성합니다.

원하는 소프트웨어를 사용하여 스페로이드의 3D 렌더링을 얻으려면 먼저 SD OCT 데이터를 소프트웨어에 로드합니다. 능가 하는 패널을 클릭 하 여 새 볼륨을 추가 하 고 3D 렌더링에 사용할 혼합 모드를 선택 합니다. 시야각을 조정하려면 마우스 포인터를 사용하여 이미지를 드래그하고 원고에 설명된 대로 정량화를 진행합니다.

HCT116 세포주 스페로이드의 FAZED OCT 이미지의 콜라주 처리된 데이터는 처리된 데이터에서 생성되었으며, 다른 2D 고처리량 이미징 시스템의 이미지와 비교할 수 있는 결과가 생성되었습니다. 더욱이, 96개의 우물에서 2D 단면 스페로이드 이미지의 콜라주는 스페로이드 높이를 모니터링하고 수직 방향으로 스페로이드 불균일성을 시각화하기 위해 생성되었다. 3D 렌더링 스페로이드 이미지의 콜라주를 미리 정의된 각도에서 생성하여 전체 3D 모양을 시각화하고 스페로이드의 원도를 평가할 수 있습니다.

일반적인 OCT 후 처리 후, 종양 스페로이드의 3D OCT 구조 이미지가 얻어졌다. OCT 데이터로부터, 3D 표면 포스트 및 XZ, YZ 및 XY 직교 슬라이스가 어떤 방향으로든 종양 스페로이드의 구조를 시각화하기 위해 생성되었다. 단일 종양 스페로이드의 경도 모니터링은 직경, 높이 및 복셀 기반 부피를 특성화하여 21일 간의 개발 기간 동안 크기와 부피의 성장 곡선을 생성하도록 수행되었다.

여기서 스페로이드는 11일째에 중단되었고, 21일째에 완전히 붕괴되었습니다. 세로 추적은 종양 스페로이드에서 죽은 세포 영역의 증가를 보였다. 종양 스페로이드의 3D 렌더링 된 이미지는 빨간색 강조 괴사 영역의 증가에 의해 나타난 바와 같이 7 일부터 14 일까지 죽은 세포 영역의 모양과 성장을 보여 주었다.

괴사 영역의 비율이 증가함에 따라 종양 스페로이드는 완벽한 모양을 유지할 수 없었고, 따라서 붕괴되었습니다. 이 이미징 플랫폼을 통해 우리는 생체 종양에서 더 잘 시뮬레이션하기 위해 3D 이미징 모델, 광대 한 생물 모델 및 공동 배양 모델과 같은 다른 복잡한 종양 구 모델을 더 탐구 할 수 있습니다. 우리의 높은 처리량 OCT 화상 진찰 시스템은 암 약 발견에 있는 약 검열을 위한 변경접근을 제공할 수 있습니다.

이것은 또한 특징의 무언가, 다양한 생물 의학 응용 프로그램에 대한 3D 생체 제작 샘플.