Name: Analisando a taxa de consumo de oxigênio em Mouse culto principal Cardiomyocytes Neonatal utilizando um analisador de fluxo extracelular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprenda a medir o consumo de oxigênio em cardiomiocitos neonatais de camundongo usando analisador de fluxo extracelular. Este método permite avaliar a função mitocondrial em formato de 96 poços com alta reprodutibilidade.

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Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório de Murphy e laboratório de Ross. Este trabalho é apoiado pela associação americana do coração (14SDG17790005) para Y.C. NIH (HL115933, HL127806) e mérito de VA (BX003260) para R.S.R.

Para trabalho com ratos neonatais, por favor consulte a universidade local/Instituto conjunto de diretrizes adiante pelos programas de cuidados com animais e aderir a institucionais e outros regulamentos adequados. Todos os métodos descritos no presente protocolo tenham sido aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) e UC San Diego institucional Cuidado Animal e aderirem aos regulamentos federais e estaduais.
1. preparação dos reagentes
<ol><li>Prepare-se 25 mL da solução de pré-digestão: HBSS (sem o Ca2 + e Mg2 +) suplementado com tripsina (0,5 mg/mL). Esterilizar a solução usando um filtro de 0,22 µm e manter no gelo até o uso. Fazer pré-digestão solução no dia do experimento. Nota: É fundamental usar HBSS sem Ca2 + e Mg2 +, como Ca2 + e Mg2 + causará contração miócito e morte celular subsequente durante o isolamento.</li>
	<li>Prepare 30 mL de tampão de digestão de colagenase: colagenase (0,8 mg/mL, aproximadamente 350 U/mL) dissolvido em tampão HBSS (sem o Ca2 + e Mg2 +). Esterilizar a solução usando um filtro de 0,22 µm e manter no gelo até o uso. Fazer a solução de digestão de colagenase no dia do experimento.</li>
	<li>Preparar 500 mL de casos cultura media (mídia de crescimento): misture 375 mL de DMEM, 125 mL de M-199, 25 mL de soro de cavalo e 12,5 mL de FBS. Suplemento com penicilina 1% e 1% solução de estreptomicina.</li>
	<li>Preparar o meio de teste de estresse mitocondrial: fazer 200 mL de DMEM com base em teste de estresse suplementado (DMEM sem NaHCO3, consulte Tabela de materiais) com piruvato de sódio 1 mM, 2 mM L-glutamina e glicose 10 mM e 2 mM Hepes. Nota: Faça 1 L de meio com DMEM sem piruvato de sódio, L-glutamina, glicose e Hepes, limador estéril e armazene em 4 ° C. Prepare o suporte de teste de stress no dia do ensaio, adicionando outros reagentes. Usando DMEM meio sem NaHCO3 é crítico.</li>
	<li>Ajuste o pH da mídia mitocondrial teste de estresse para 7.4 no dia da utilização. Mídia aquecida a 37 ° C antes do uso.</li>
	<li>Preparar oligomicina: Prepare-se 5 mL de uma solução stock de 5mm em DMSO, fazer 250 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C.</li>
	<li>Prepare-se Compararia: Prepare-se 5 mL de uma solução stock de 5mm em DMSO, fazer 250 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C.</li>
	<li>Prepare-se antimycin A: Prepare-se 5 mL de uma solução stock de 5mm em DMSO, fazer 250 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C.</li>
	<li>Preparar a rotenona: Prepare-se 5 mL de uma solução stock de 5mm em DMSO, fazer 250 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C. Nota: Todos os reagentes e soluções utilizados neste protocolo são listadas na tabela 1.</li>
</ol>2. colheita e pré-digestão de corações de ratos Neonatal (dia 1)
<ol><li>Autoclave tesouras, pinças e uma colher de Moria para esterilizar.</li>
	<li>Execute todas as etapas do capuz de cultura celular para esterilidade.</li>
	<li>Alíquota 5 mL de HBSS (sem o Ca2 +, Mg2 +) em cada poço de uma placa de cultura de células de 6-poços; Coloque no gelo. Alíquota 10 mL de HBSS em um prato de cultura de célula de 10 cm.</li>
	<li>Prepare-se 20 mL da solução de tripsina pré-digestão em um tubo cônico estéril de 50 mL. Mantenha todas as soluções no gelo.</li>
	<li>Mergulhe rapidamente os ratos recém-nascido (dia 0) em solução de etanol 70% para a esterilização.</li>
	<li>Decapitar filhotes usando uma tesoura esterilizada (direto) sem anestesia e então abra o baú ao longo do esterno para permitir o acesso à cavidade torácica e o coração. (Figura 1A) Nota: 1) é fundamental usar ratos neonatais P0 para alcançar a viabilidade celular alta. 2) este método de eutanásia é permitido para recém-nascidos em conformidade com diretrizes de NIH e Associação Médica Veterinária americana 17.</li>
	<li>Extrair o coração de um corpo com uma tesoura bem e transferir imediatamente para o prato de cultura de células estéreis contendo HBSS (sem o Ca2 +, Mg2 +) (figura 1B).</li>
	<li>Remover qualquer tecido pulmonar residual, vasos maiores, etc. (e átrios, se desejado). Lave os corações na solução HBSS usando agitação suave.</li>
	<li>Corte cada coração com uma tesoura bem em 8 pedaços e transferir o todo o tecido cardíaco com pinças em um poço de uma placa de cultura de células de 6-poços com HBSS (Figura 1 e 1 D).</li>
	<li>Lave os corações, transferindo os corações de bem para bem na placa 6-bem preenchida com HBSS, usando uma colher de Moria (Figura 1). Nota: Transferir os corações de poço para poço é suficiente para lavar o sangue. Desde que o sangue interfere com a digestão enzimática é importante lavar os corações com HBSS e remover o sangue.</li>
	<li>Transferir os corações com uma colher de Moria em um tubo cônico contendo 20 mL de tripsina (0,5 mg/mL) e incubar com agitação suave a 4° C por 4 h (Figura 1E).</li>
</ol>3. prepare uma placa de cultura de 96 poços (dia 1)
<ol><li>Prepare-se 5 mL da solução de revestimento: PBS contendo 0,5% de gelatina (autoclave antes do uso) e 1% solução de fibronectina. (por exemplo, 5 mL de solução de gelatina mais 50 µ l de solução de fibronectina)</li>
	<li>Alíquota 50 µ l de solução de revestimento em cada poço da placa de cultura de células 96 poços (ver Tabela de materiais). Se as bolhas estiverem presentes, removê-los usando uma pipeta de 20 µ l de chupar as bolhas para fora. Nota: É importante cobrir toda a área da superfície de cada poço com solução de revestimento.</li>
	<li>Incube a placa numa incubadora de cultura de célula de 37 ° C por 1h ou mais para permitir a secagem do revestimento matriz.</li>
	<li>Aspire qualquer solução de revestimento residual antes da semeadura cardiomyocytes.</li>
</ol>4. enzimática digestão e chapeamento de células (dia 1)
<ol><li>Pré-aquecer a solução de digestão de colagenase em banho maria a 37 ° C. Nota: Este passo é importante para alcançar eficiente digestão enzimática.</li>
	<li>Mova o tubo cônico contendo solução de pré-digestão de 4 ° C para uma capa de cultura celular e corações. (Figura 1F)</li>
	<li>Deixe o coração afunda até o fundo do tubo e remove a solução de pré-digestão usando uma pipeta sorológica 10ml (1 a 2 mL do meio de isolamento podem permanecer no tubo).</li>
	<li>Adicione 10 mL de HBSS dentro do tubo. Re-suspender os corações com HBSS 2 - 3 vezes a desbotar tripsina utilizando uma pipeta sorológica 10ml. Aspire HBSS (1 a 2 mL podem permanecer no tubo).</li>
	<li>Adicione 10 mL de solução de digestão de colagenase previamente aquecido dentro do tubo com corações. (Figura 1)</li>
	<li>Incubar o tubo com corações em banho-maria 37 ° C por 10 min sem agitação (1º digestão).</li>
	<li>Após a digestão 1º, mova o tubo ao capô de cultura de células. Delicadamente, Triture corações, re-suspendendo os corações no interior do tubo suavemente 10 vezes utilizando uma pipeta sorológica 10ml. Isto permitirá que corações para dispersar e células ser liberado do tecido cardíaco. (Figura 1 H) Nota: Desde que cardiomyocytes são frágeis, trituração suave é importante para alcançar alta viabilidade.</li>
	<li>Deixe o tecido não digerido afundar, transferir a solução digerida enriquecida em cardiomyocytes (aproximadamente 9-10 mL) para um novo tubo cónico e imediatamente adicionar uma quantidade igual de meios de cultura celular para parar a digestão de colagenase.</li>
	<li>Adicione 10 mL de solução de digestão de colagenase no tubo contendo o tecido restante do coração não digerido.</li>
	<li>Incubar o tubo com o tecido do coração em um banho de água de 37 ° C por 10 min (2º digestão).</li>
	<li>Repita o procedimento 4.7 e 4.8. Nota: Se há tecido muito ainda não digerido, repita a digestão mais uma vez. No entanto, na maioria dos casos, duas digestões são suficientes para dispersar a maioria das células do tecido do coração.</li>
	<li>Coloque um celular-filtro estéril (100 µm de malha de nylon) em um novo tubo cônico estéril 50 mL. Pre-molhado o filtro célula com 2-3 mL de meio de cultura celular e passar as células até a célula-filtro. Lave o filtro-célula com 2-3 mL de meio de cultura celular. (Figura 1I)</li>
	<li>Centrifugar o tubo cônico contendo cardiomyocytes por 5 min a 180 x g (Figura 1J). Aspire o sobrenadante (Figura 1 K), que irá conter os restos de tecido celular e ressuspender o sedimento celular em 10 mL de meio de cultura celular (Figura 1 L).</li>
	<li>Delicadamente Ressuspender as células e as células da placa numa placa de cultura de células de 10 cm (sem qualquer tipo de revestimento de plástico) e incube por 1h em uma incubadora de cultura celular (1º pré-plating) (Figura 1 M). Esta etapa pré-chapeamento permite que não-cardiomyocytes, como fibroblastos e células endoteliais, para aderir ao prato sem revestimento de cultura de células. Nota: Neste ponto, cardiomyocytes são normalmente uma forma redonda e aspecto brilhante ao microscópio. (Figura 1N).</li>
	<li>Após a incubação de 1 h, suavemente agitar a placa, lavar as células não-aderente (enriquecidas em cardiomyocytes) da placa de cultura de 10 cm e ressuspender as células pipetando repetidamente o meio de cultura celular sobre o prato com uma pipeta sorológica 10ml. Em seguida, transferir as células não-aderente (enriquecidas em cardiomyocytes) para uma nova placa de cultura de células de 10 cm (sem qualquer revestimento de plástico) e incubar durante uma 1h adicional em uma incubadora de cultura celular (2ª pré-plating). Nota: As células que prendem a placa não revestidos são predominantemente não-cardiomyocytes: fibroblastos e células endoteliais, que podem ser visualizadas sob um microscópio (Figura 1O).</li>
	<li>2º Pré-chapeamento, suavemente agitar a placa, lavar as células não-aderente (cardiomyocytes) do prato 10cm cultura depois de transferir o cardiomyocytes para um novo tubo cónico de 50 mL.</li>
</ol>5. contagem de células e chapeamento de células em uma placa de cultura de células 96 poços (dia 1)
<ol><li>Conte as células usando um hemocytometer.</li>
	<li>As células da placa em uma placa de cultura de células 96 poços revestida da matriz extracelular em uma densidade entre 10 a 30 x 103 células/poço usando uma pipeta multicanal em um volume final de 200 µ l (Figura 1 P). Use poços A1, A12, H1 e H12 para plano de fundo: Adicionar 200 µ l de meio de cultura como outros poços nesses poços (sem pilhas). Incube a placa numa incubadora de cultura de células de 37 ° C. Nota: Neste estudo, o consumo de oxigênio foi testado usando densidades de célula diferente como 10 x 103, 20 x 103ou 30 x 103 células/poço. (Figura 2A). Também, como acima, cardiomyocytes imediatamente depois de isolamento são geralmente uma forma redonda e aspecto brilhantes ao microscópio. Células viáveis vão achatar dentro 16-24h de cultura.</li>
</ol>6. oxigênio consumo ensaio utilizando um analisador de fluxo extracelular 96-bem-formato (dia 2)
Nota: Ensaio de consumo de oxigênio pode ser realizado um dia depois do chapeamento as células ou mais tarde. Cardiomyocytes neonatal cultivadas usando este protocolo pode sobreviver até 7 dias pós o isolamento.
<ol><li>Hidratar um cartucho de sensor de analisador de fluxo (ver Tabela de materiais) para pelo menos 3 horas, mas idealmente para um dia inteiro, antes do ensaio. Adicionar 200 µ l de solução de Calibrant (ver Tabela de materiais) em cada poço da placa de utilitário, volte a colocar o cartucho do sensor na placa de utilitário e incubar em uma incubadora de 37 ° C sem CO2 ou suplementação de2 O.</li>
	<li>Mudar de meios de cultura celular para meio de teste de estresse de mitocôndrias uma hora antes do ensaio. Cardiomyocytes são frágeis. Portanto, suavemente remover os meios de cultura de células usando uma pipeta multicanal e lavar as células com 200 µ l de mídia mitocondrial pré-aquecido estresse teste duas vezes. Depois da segunda lavagem, adicione 175 µ l de mídia de teste de estresse de mitocôndrias pré-aquecido e cultura de células em uma incubadora de 37 ° C sem CO2 ou suplementação de2 O.</li>
	<li>Prepare teste concentrada compostos. Teste de estresse de mitocôndrias, prepare 3,0 mL de 16 µM oligomicina, 9 µM Compararia e uma mistura de 20 rotenona µM e 20 µM antimycin A, tudo no meio de teste de estresse mitocondrial. Nota: Cada composto na concentração descrito foi testado. No entanto, titulada a concentração de cada composto no próprio laboratório é necessária.</li>
	<li>Carrega 25 µ l de cada composto para os portos de injector do cartucho sensor usando uma pipeta multicanal (Figura 1T). O volume e a concentração final são descritos na tabela 2.</li>
	<li>Configure o protocolo de ensaio de fluxo extracelular. O programa está descrito no tabela 3.
</li>
	<li>Inicie o programa. Primeiro, coloque o cartucho de sensor na máquina para calibração (Figura 1R). Substitua o calibrant para a placa de ensaio, uma vez que a etapa de calibração é feita. Nota: Usando o software fornecido pelo fabricante, indicam que grupos de poços e cada composto e Porto.</li>
	<li>Se desejado, após o ensaio, cuidadosamente descartar todos doseamento usando uma pipeta multicanal e armazenar a microplaca de cultura de célula a-20 ° C para normalização futura célula usando o ensaio da proteína.</li>
	<li>Medir o teor de proteína. Adicionar 50 µ l de solução de lise celular RIPA padrão (veja a Tabela de materiais). Incube a placa no gelo por 30 min para totalmente lyse pilhas. Transferi todo o material para uma nova placa de ensaio bem fundo claro plano 96.</li>
	<li>Medir a concentração de proteína por ensaio BCA de acordo com o protocolo do fabricante. Nota: Revestimento do poço com matriz extracelular resulta em uma concentração de proteína em cada poço. Portanto, subtrai a quantidade de well(s) o plano de fundo (sem pilhas) para obter a concentração de proteína de célula real. A concentração de proteínas derivada de células é baixa em uma placa de cultura de 96 poços. Além disso, a concentração de proteína pode variar de para-bem graças ao revestimento de matriz extracelular. Portanto, usar o número do celular para normalizar o OCR é sugerido.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Neste estudo, nós estabelecemos um protocolo simples para isolar e cultivar cardiomyocytes neonatal do mouse. Usando estes cardiomyocytes, nós também Aperfeiçoamos as condições para medir a taxa de consumo de oxigênio por meio de um sistema analisador de fluxo extracelular. O protocolo permite que se use rato neonatal cardiomyocytes como um sistema modelo para examinar como vários fatores podem alterar o consumo de oxigênio nas células de trabalho principal do coração, semelhante ao que seria medido no órgão intacto. Nos...

Para sustentar uma função contrátil cardíaca contínua, cardiomyocytes deve manter um fornecimento constante de energia celular, principalmente na forma de ATP1. No coração, aproximadamente 95% de ATP é gerado pela mitocôndria, principalmente através da fosforilação oxidativa, mostrando que as mitocôndrias desempenham um papel bioenergético crucial na função cardíaca2,3. Esta noção de apoio é que a desregulação da função mitocondrial pode levar a miocardiopatia e insuficiência cardíaca4,5. Por outro lado, restaurar a função mitocondrial foi mostrado para melhorar a função cardíaca de falhar o coração6,7. Portanto, estudar o mecanismo de bioenergética mitocondrial e identificando novos reguladores da função mitocondrial em cardiomyocytes não revelarei apenas insights mecanicistas de produção de energia cardíaca, mas também poderiam fornecer uma visão que vai levar para o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos para tratar doenças cardíacas6,8.
Em comparação com todo o coração, que contém uma mistura de miócitos e miócitos não9, casos de culturas são extremamente puro, com contaminação mínima de non-miócitos do coração, como fibroblastos e células endoteliais10. Além disso, isolar cardiomyocytes de filhotes neonatais permite cultivo um grande número de células em uma pequena quantidade de tempo, em comparação com células isolantes de corações adultos10,11. Mais importante ainda, principal do rato adulto culto cardiomyocytes têm curta sobrevivência vezes (por exemplo, 24 h) e no tempo mais pontos de diferenciam. Cardiomyocytes rato neonatal pode sobreviver e ser manipulado por mais de 7 dias em cultura, tornando-os ideais para testar os efeitos dos compostos de drogas e manipulação genética sobre a função das mitocôndrias em cardiomyocytes10. Claro, existem significativas diferenças biológicas entre as células de adultas e Neonatais, mas a duração mais longa disponível para cultura de células neonatais fá-los apropriados para diversos tipos de estudos, incluindo os da função mitocondrial.
Até à data, principal culto neonatal camundongo e rato cardiomyocytes têm sido utilizados como modelos para estudar bioenergética cardíaca12,13. Nos últimos anos, estudos utilizados um analisador de fluxo extracelular para medir a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e avaliar a capacidade oxidativa em camundongo e rato neonatal cardiomyocytes14,15. Enquanto comparado com ratos, a viabilidade celular de rato cardiomyocytes neonatal é mais baixa e tem maior variabilidade16. Também, a capacidade de estudar células de modelos do rato geneticamente o modelo de célula de rato faz muito importante. Dado que os estudos de OCR são tão sensíveis ao celular número e densidade de semeadura, desenvolvimento de um protocolo simples, confiável e reprodutível para alcançar a viabilidade e rendimento consistente da célula é necessário.
Aqui, nós relatamos um protocolo otimizado que tem sido desenvolvido que usa culta rato neonatal cardiomyocytes juntamente com um analisador de fluxo extracelular 96-bem-formato para análise de OCR. Este protocolo aumenta a reprodutibilidade do ensaio. Além disso, o protocolo não só fornece um método reprodutível para análise de OCR e romance, mas também pode ser adaptado para uma cultura de tamanho maior para outros fins experimentais, como a que pode ser necessária para estudar funções miofibrilar e intracelular vias de sinalização.
Em particular, este protocolo descreve um procedimento de um dia para isolamento e cultura de rato neonatal cardiomyocytes em uma placa de cultura de células 96 poços. Além disso, ele descreve o procedimento para medir o consumo de oxigênio, usando um analisador de fluxo extracelular. Todas as soluções utilizadas são estéreis ou filtrado estéril. Todas as ferramentas são esterilizadas por 75% de etanol. Nós fornecemos uma Tabela de materiais para várias partes do processo. Para cultivo cardiomyocytes, todos os procedimentos e as etapas são executadas em uma capa de cultura de célula padrão. Este protocolo é desenvolvido para o isolamento de corações de rato neonatal de uma ninhada (aproximadamente 8-10 filhotes). No entanto, o protocolo também pode ser adaptado para isolar cardiomyocytes de várias ninhadas.

<table><tbody><tr><td>Antimicina A</td><td>SIGMA</td><td>A8674</td><td>Inibe o complexo III da mitocôndria</td></tr><tr><td>Filtro celular 100 &mu; m poros</td><td>FALCON</td><td>352360</td><td>Para capturar tecido não digerido</td></tr><tr><td>Colagenase tipo II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>Para fazer solução de digestão de colagenase</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>SIGMA</td><td>75351</td><td>Para fazer meio de teste de estresse mitocondrial</td></tr><tr><td>DMEM alta glicose</td><td>Tecnologias de vida</td><td>11965-092</td><td>Para fazer meio</td></tr> <tr><td>de cultura celularDMEM sem NaHCO3, glicose, piruvato, glumanina e hepes</td><td>SIGMA</td><td>D5030-10X1L</td><td>Para fazer o meio de teste de estresse mitoconrial</td></tr><tr><td>FCCP (cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona)</td><td>SIGMA</td><td>C2920</td><td>Desacopla a respiração mitocondrial</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>26140-079</td><td>Para fazer meio de cultura de células</td></tr><tr><td>Fibronectina de plasma bovino</td><td>SIGMA</td><td>F1141-5MG</td><td>Para fazer solução de revestimento para placas de cultura de tecidos</td></tr><tr><td>Tesouras finas</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>14060-10</td><td>Para dissecção de corações</td></tr><tr><td>Gelatina de pele suína</td><td>SIGMA</td><td>G-1890</td><td>Para fazer solução de revestimento para placas de cultura de tecidos</td></tr><tr><td>HBSS (solução salina balanceada de Hank, sem Ca2+, Mg2+)</td><td>Cellgro</td><td>21-022-CV</td><td>Para lavar corações e fazer solução de pré-digestão e digestão de collagnase</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Fisher scientific</td><td>15630080</td><td>Para fazer meio de teste de estresse mitocondrial</td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>Life technologies</td><td>26050-088</td><td>Para fazer meio de cultura de células</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>SIGMA</td><td>G-3126</td><td>Para fazer meio de teste de estresse mitocondrial</td></tr><tr><td>M-199</td><td>Cellgro</td><td>10-060-CV</td><td>Para fazer meio de cultura de células</td></tr><tr><td>Colher Moria</td><td>Fisher NC9190356 científica</td><td></td><td>Para lavar corações&nbsp;</td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>SIGMA</td><td>75351-5MG</td><td>Inibe a ATP sintase mitocondrial</td></tr><tr><td>Tampão RIPA</td><td>Fisher scientific</td><td>89900</td><td>Para lisar as células para ensaio de proteína</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>SIGMA</td><td>R8875</td><td>Inibe o complexo I das mitocôndrias</td></tr><tr><td>Analisador de Fluxo Extracelular XFe96 do Cavalo><-Marinho XFe96 Dispositivo</td><td>Agilent</td><td></td><td>usado para analisar a taxa de consumo de oxigênio</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102601-100</td><td>Pacote de placas de cultura de analisador de fluxo, cartuchos de sensor e calibrante</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>SIGMA</td><td>P2256</td><td>Para fazer teste de estresse mitocondrial médio</td></tr><tr><td>Tesoura reta</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>91401-12</td><td>Para dissecção de corações</td></tr><tr><td>Filtro de seringa 0,2 &mu; tamanho</td><td></td><td></td> m <td>Para filtração estéril do meio de digestão</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>USB Corporation</td><td>22715 25GM</td><td>Para fazer solução de pré-digestão</td></tr></tbody></table>

analisando a taxa de consumo de oxigênio em mouse culto principal cardiomyocytes neonatal utilizando um analisador de fluxo extracelular

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Mitocôndrias e metabolismo oxidativo são essenciais para manter a função do músculo cardíaco. A pesquisa mostrou que a disfunção mitocondrial é um importante fator contribuinte para insuficiência cardíaca encontrada na insuficiência cardíaca. Por outro lado, restaurar a função mitocondrial defeituosa pode ter efeitos benéficos para melhorar a função cardíaca no coração falhar. Portanto, estudar os mecanismos de regulação e identificando novos reguladores de função mitocondrial poderiam fornecer uma visão que poderia ser usada para desenvolver novos alvos terapêuticos para o tratamento de doenças cardíacas. Aqui, a respiração mitocondrial miócito cardíaco é analisada usando um sistema de cultura de célula única. Primeiro, um protocolo foi otimizado para isolar rapidamente e cultura alta viabilidade neonatal do mouse cardiomyocytes. Então, um analisador de fluxo extracelular de 96 poços formato é usado para avaliar a taxa de consumo de oxigênio destas cardiomyocytes. Para este protocolo, nós otimizado semeadura condições e demonstrou que essa taxa de consumo de oxigênio de cardiomyocytes rato neonatal pode ser facilmente avaliada em um analisador de fluxo extracelular. Finalmente, notamos que nosso protocolo pode ser aplicado a um tamanho maior de cultura e outros estudos, tais como sinalização intracelular e contrátil função de análise.

Usando o protocolo descrito, corações foram isoladas de filhotes neonatal dia 0. 5 x 105 células/filhote foram obtidos, e cardiomyocytes foram semeadas em densidades de 10 x 103, 20 x 103ou 30 x 103 células/poço, em 96 placas bem (Figura 2A). Depois da cultura durante a noite, foram encontrados cardiomyocytes bem anexado à superfície revestida de plástico e havia muito poucas células solteira (as células não anexada...

O objetivo do presente protocolo é ilustrar como usar rato neonatal cardiomyocytes como um sistema modelo para examinar como vários fatores podem alterar o consumo de oxigênio no coração.

Analisando a taxa de consumo de oxigênio em Mouse culto principal Cardiomyocytes Neonatal utilizando um analisador de fluxo extracelular

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

Este protocolo nos permite isolar e cultivar alto bi-BBT, conhecido apenas pelos cardiomiócitos do rato. Para avaliar a função mitocondrial, a taxa de consumo de oxigênio dos cardiomiócitos pode ser analisada por um analisador de fluxo de prata real. Uma das vantagens dessa técnica é que o consumo de oxigênio de cardiomiócitos pode ser facilmente medido em seu estado de aderente em formato de 96 poços, o que permite o teste de múltiplas condições com um grande número de réplicas.Esta embarcação fornece importantes insights sobre a área de pesquisa da cardiologia. Além do consumo de oxigênio, também podemos estudar outros parâmetros metabólicos, como agrices cinza e a epóxida peraciada. Alcançar alta variabilidade de cardiomiócitos é fundamental para este experimento.Isso requer uma digestão eficiente dos corações. Uma vez que os cardiomiócitos neo-natal são muito frágeis, o manuseio suave de cardiomiócitos também é importante. Na capa de cultura celular, alíquota de 5ml de HBSS para cada poço de uma placa de cultura celular de 6 poços e colocá-lo no gelo.Além disso, aliquot 10ml de HBSS para um prato de cultura celular de 10cm, em seguida, preparar 20 ml de solução de Predigestion Trypsin em um tubo cônico estéril de 50ml. Mantenha todas as soluções no gelo. Em seguida, extraia o coração e transfira-o imediatamente para o prato de cultura celular estéril contendo HBSS.Remova qualquer tecido pulmonar residual e vasos maiores. Lave o coração no HBSS usando agitação suave. Posteriormente, corte o coração com uma tesoura fina em 8 pedaços e transfira o tecido cardíaco com fórceps em um poço de uma placa de cultura celular de 6 poços com HBSS.Usando uma colher de moria, lave o tecido cardíaco transferindo-o de poço para poço na placa de 6 poços cheia de HBSS. Em seguida, transfira o tecido cardíaco para um tubo cônico contendo 20ml de Trippsin e incubar com agitação suave a 4 graus celsius por 4 horas. Neste procedimento, pré-aquecimento a solução de digestão de colagenase em um banho de água a 37 graus celsius.Transfira o tubo cônico contendo tecido cardíaco e solução de predileção de 4 graus celsius para uma capa de cultura celular. Deixe o tecido cardíaco afundar até o fundo do tubo e remova a solução de predileção usando uma pipeta sorológica de 10ml. Em seguida, adicione 10ml de HBSS no tubo.Resuspenja o tecido cardíaco com HBSS 2 a 3 vezes para lavar a Trippsin usando uma pipeta sorológica de 10ml. Aspire HBSS e adicione 10ml de solução de digestão de colagem pré-w armada no tubo com tecido cardíaco. Para a primeira digestão, incubar o tubo com tecido cardíaco em um banho de água a 37 graus celsius por 10 minutos sem agitação.Depois, transfira o tubo para o capô da cultura celular. Triturar o tecido reutilizando-o suavemente 10 vezes usando uma pipeta sorológica de 10ml. Isso permitirá que o coração se disperse e as células sejam liberadas do tecido cardíaco.Deixe o tecido não digerido afundar. Transfira a solução digerida enriquecida em cardiomiócitos para um novo tubo cônico e adicione imediatamente uma quantidade igual de meio de cultura celular para parar a digestão da colagemnase. Em seguida, adicione 10ml de solução de digestão de colagenase no tubo contendo o tecido cardíaco não digerido restante.Para a segunda digestão, incubar o tubo com tecido cardíaco em um banho de água de 37 graus celsius por 10 minutos. Repita os procedimentos da primeira digestão e transfira a solução digerida enriquecida em cardiomiócitos para um novo tubo cônico antes de parar a digestão da colagemnase. Em seguida, coloque um coador de células estéreis em um novo tubo cônico estéril de 50ml.Pré-molhar o coador celular com 2 a 3 ml de meio de cultura celular e passar as células através do coador celular. Posteriormente, enxágue o coador celular com meio de cultura celular. Em seguida, centrífuga o tubo cônico contendo cardiomiócitos por 5 minutos a 180 vezes a gravidade.Após 5 minutos, aspire o supernaspe e resuspense a pelota celular em 10ml de meio de cultura celular. Coloque as células em um prato de cultura celular de 10cm e incuba-as por uma hora. Depois, agitar suavemente o prato.Lave as células não aderentes e resuspenja as células, encanar repetidamente o meio de cultura celular sobre o prato usando uma pipeta sorológica de 10ml. Em seguida, transfira as células não aderentes para um novo prato de cultura celular de 10cm e incuba-as por mais uma hora. Depois de uma hora, agitar suavemente a placa e lavar as células não aderentes.Transfira os cardiomiócitos para um novo tubo cônico de 50ml. Em seguida, prepare uma placa de cultura de 96 poços, aliquoting 50 microliters de solução de revestimento em cada poço da placa de cultura celular de 96 poços. Se as bolhas estiverem presentes, remova-as usando uma pipeta de 20 microliter.Incubar a placa a 37 graus celsius por pelo menos uma hora para permitir a secagem do revestimento da matriz. Em seguida, conte as células usando um hemótmetro. Coloque as células na matriz extra-celular revestida de placa de cultura celular de 96 poços a uma densidade entre 10 a 30 mil células por poço.E coloque as células na incubadora. Para pré-formar o ensaio de consumo de oxigênio, hidrate um cartucho de sensor analisador de fluxo por pelo menos 3 horas, adicione 200 microliters de solução calibrante em cada poço da placa de utilidade. Coloque o cartucho do sensor de volta na placa do utilitário e incubar em 37 graus celsius sem suplementação de CO2 ou O2 por pelo menos 3 horas.Uma hora antes do ensaio, remova suavemente o meio de cultura celular e lave as células com 200 microliters de meio de teste de estresse mitocondrial pré-armado duas vezes. Após a segunda lavagem, adicione 175 microliters de meio de teste de estresse mitocondrial pré-armado. Em seguida, cultura as células a 37 graus celsius sem dióxido de carbono ou suplementação de oxigênio.Prepare 3ml de cada um dos compostos de teste no meio de teste de estresse mitocondrial. Carregue 25 microliters de cada composto nas portas injetoras do cartucho do sensor usando uma pipeta multicanal. O estado das células e quaisquer pré-tratamentos podem afetar a restauração máxima provocada pela injeção de fccp desacoplador.A sensibilidade celular ao desacoplador também pode mudar, portanto, é fundamental otimizar a concentração de trabalho do FCCP para cada tratamento específico. Posteriormente, configure o protocolo de ensaio de fluxo extracelular e inicie o programa. Primeiro, coloque o sensor cartiridge na máquina para calibração.Substitua o calibrante para a placa de ensaio quando a etapa de calibração for feita. Se desejar, após o ensaio, descarte cuidadosamente todo o meio de ensaio usando uma pipeta multicanal. E armazene a cultura celular mircopolando a 20 graus celsius negativos para futura normalização celular usando ensaio proteico.Por meio do protocolo descrito, os corações foram isolados a partir do dia 0 filhotes neo-natal e cardiomiócitos foram semeados em densidades de 10, 20 ou 30 mil células por poço em placas de 96 poços. Após a cultura da noite para o dia, os cardiomiócitos foram encontrados bem ligados à superfície de plástico revestida e havia muito poucas células não ligadas. Neste ponto, cardiomiócitos que contraíam espontaneamente eram facilmente visíveis.Uma densidade de semeadura de 30.000 células por poço mostrou confluência um dia após a semeadura à medida que as células se espalhavam. Os cardiomiócitos foram imunossuados com um anticorpo contra a actina alfa sarcomerica, um marcador específico de cardiomiócito. Como mostrado aqui, a maioria das células mostrou coloração positiva de alfa actinin indicando a alta pureza do isolamento cardiomiócito.Um esquema de um típico teste de estresse mitocondrial é mostrado aqui. O teste de estresse mitocondrial começa com uma medição da linha base da taxa de consumo de oxigênio, seguida pela injeção de minosina Oligo que inibe atpa's. Em seguida, o agente de desacoplamento FCCP foi injetado para medir a taxa máxima de consumo de oxigênio.Finalmente, com a injeção de dois inibidores complexos de transporte de elétrons, a respiração mitocondrial pára completamente e o OCR diminui para seu nível mais baixo. Para obter resultados consistentes e reprodutíveis. É fundamental alcançar alta sobrevivência.Por isso, é importante usar recém-nascidos recém-nascidos e tecidos cardíacos manuseados suavemente em cardiomiócitos. Usando linhas de camundongos novas ou existentes geneticamente manipuladas, este método pode ser facilmente traduzido para dados que podem levar à compreensão de novos mecanismos para a regulação bioenergérica no coração. Mitocondrial desempenham papéis-chave na função cardíaca.Esperamos que este método ajude a identificar novos reguladores e caminhos que regulam o metabolismo oxidante e encontrem novos alvos terapêuticos para o tratamento da insuficiência cardíaca.

analyzing-oxygen-consumption-rate-primary-cultured-mouse-neonatal

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fonte:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Instrumentos OroborosEste vídeo explica como o fluxo de oxigênio é usado para avaliar a respiração mitocondrial em células vivas e permeabilizadas de mamíferos. Demonstra o uso sequencial de digitonina, substratos metabólicos, ADP, um desacoplador e um inibidor para caracterizar diferentes estados respiratórios. O perfil de fluxo de oxigênio resultante revela a função mitocondrial e a eficiência do acoplamento de energia...

Medições de fluxo de oxigênio para avaliar a respiração mitocondrial em células vivas e permeabilizadas

A glicólise é um marcador metabólico definidor em vários sistemas biológicos. O monitoramento da glicólise medindo o fluxo extracelular de H+ é comum, mas requer correção para ser quantitativa e inequívoca. Aqui, demonstramos como coletar e corrigir dados de fluxo extracelular para distinguir entre fontes respiratórias e glicolíticas de acidificação extracelular.

Medição e Análise de Produção de Ácido Extracelular determinar Glicosidases Classificação

Esta técnica descreve a gravação em tempo real do consumo de oxigênio e taxas de acidificação do extracelular nos tecidos da retina explantados rato, usando um analisador de fluxo extracelular.

Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

Aqui nós introduzimos um método para usar um cateter ótico do intra-ventrículo em corações perfundidos para executar a espectroscopia da absorvência através da parede do coração. Os dados obtidos fornecem informações robustas sobre a tensão do oxigênio tecidual, bem como a utilização do substrato e o potencial de membrana simultaneamente com medidas de desempenho cardíaco nesta preparação onipresente.

Cateter de luz de queima lateral intra-cardíaco para monitoramento do metabolismo celular usando espectroscopia de absorvência transmural de corações de mamíferos perfused

O método aqui apresentado resume protocolos otimizados para avaliação de bioenergésicos celulares em haste hematopoiéticas não aderentes e células progenitoras primitivas (HSPCs) utilizando o analisador de fluxo extracelular para medir a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR) dos HSPCs em tempo real.

Avaliação de Bioenergésicos Celulares em Tronco Hematopoiético de Camundongos e Células Progenitoras Primitivas usando o Analisador de Fluxo Extracelular

A taxa de consumo de oxigênio (OCR) é um proxy comum para a função mitocondrial e pode ser usada para estudar diferentes modelos de doenças. Desenvolvemos um novo método usando um analisador Seahorse XF para medir diretamente o OCR em fatias estriatais agudas de camundongos adultos que é mais fisiologicamente relevante do que outros métodos.

Medição da taxa de consumo de oxigênio em fatias estriatais agudas de camundongos adultos

Descrevemos protocolos stepwise medindo a respiração mitocondrial de neutrófilos humanos e camundongos e células HL60 usando o analisador de fluxo extracelular metabólico.

Mensuração em Tempo Real do Perfil Bioenergético Mitocondrial de Neutrófilos

Apresentamos um novo dispositivo para medir as taxas de consumo de oxigênio (OCR) em culturas epiteliais pigmentares da retina (RPE). O dispositivo pode medir o OCR por semanas a fio em RPE cultivado em placas de cultura de células padrão com meio padrão, enquanto as placas estão em uma incubadora de cultura de células padrão.

Monitoramento de longo prazo das taxas de consumo de oxigênio em culturas epiteliais pigmentares retinianas altamente diferenciadas e polarizadas

Aqui, descrevemos em detalhes métodos para extrair macrófagos da medula óssea, baço e coração infartado e, posteriormente, avaliar o fluxo metabólico em células vivas.

Análise do fluxo metabólico ex vivo em macrófagos esplênicos e cardíacos e monócitos da medula óssea

Apresentamos um protocolo para permeabilizar seletivamente a membrana plasmática, permitindo a entrega direcionada de substratos e inibidores para avaliar a fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) em células cultivadas, superando barreiras de transporte da membrana plasmática que normalmente dificultam essa análise. Usando essa técnica, demonstramos como a função do OXPHOS é modulada por agonistas muscarínicos e antagonistas.

Modulação dependente de ligante colinérgico do acoplamento de fosforilação oxidativa em células de neuroblastoma BE(2)-C permeabilizadas por digitonina

Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado para quantificar a taxa de consumo de oxigênio e a taxa de acidificação extracelular dos ventrículos adultos ex vivo de peixe-zebra, a fim de caracterizar sua capacidade metabólica oxidativa e glicolítica.

Avaliação da atividade metabólica dos ventrículos inteiros regeneradores de peixe-zebra ex vivo usando um ensaio de fluxo extracelular

Aprenda a medir o consumo de oxigênio em cardiomiocitos neonatais de camundongo usando analisador de fluxo extracelular. Este método permite avaliar a função mitocondrial em formato de 96 poços com alta reprodutibilidade.

Analisando a taxa de consumo de oxigênio em Mouse culto principal Cardiomyocytes Neonatal utilizando um analisador de fluxo extracelular (Vídeo) | JoVE Journal

Analisando a taxa de consumo de oxigênio em Mouse culto principal Cardiomyocytes Neonatal utilizando um analisador de fluxo extracelular

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