Изоляция Папиарной и Ретикулярная фибробласты от человеческой кожи путем флуоресценции активированной ячейки сортировка

Этот протокол облегчает изоляцию функционально различных фибробластов от кожи человека путем сортировки FAC на основе выражения маркера поверхности клетки. Впервые папиллярные и ретикулярные фибробласты могут быть изолированы непосредственно от кожи без манипуляций с пробирки. Это огромный прогресс по сравнению с ранее установленными методами изоляции с использованием культур explant.

Дермальные подмножества фибробластов питают различные функции в гомеостатической обстановке. С помощью этого инструмента можно исследовать функциональные различия в патологиях кожи, включая рак или воспалительные заболевания кожи. Поскольку обработка человеческой ткани требует некоторой практики для достижения удовлетворительных урожаев клеток, мы хотели бы обеспечить визуальную демонстрацию для облегчения и ускорения этого процесса.

Чтобы подготовить полную толщину дермы, поместите кусок человеческой кожи на толстую фильтровальную бумагу с эпидермисом лицом вниз. Держите эпидермис плотно с типсами, и соскребать подкожный слой жира скальпелем. Затем нарежьте ткань полосками шириной в пять миллиметров, прежде чем положить их в чашку Петри.

Чтобы раздел дермы на папиллярные и ретикулярные слои, поместите кусок кожи на толстую фильтровальную бумагу с эпидермисом, обращенным вверх. Держите кожу плотно по краям с типсами, и нарезать раздел толщиной 300 микрометров с электрическим дерматомом. Перенесите первый слой, состоящий из эпидермиса и папиллярной дермы, в чашку Петри.

Затем немедленно перейти к отделить эпидермис и дермы, или добавить 1x PBS держать ткани от высыхания. Затем отрегулируйте дерматом до толщины резки 700 микрометров и нарежьте оставшуюся дерму. Поместите верхний кусочек, который определяется как верхний ретикулярный дермы, в отдельную чашку Петри.

Впоследствии, соскребать подкожный слой жира скальпелем из остаточного нижнего ретикулярного дермального слоя, и отбросить его. Соберите нижнюю ретикулярную дерму в другом блюде Петри. Немедленно приступайте к процедуре энзиматической пищеварения или добавьте 1x PBS, чтобы ткань не высохла.

Для выполнения ферментативного пищеварения поместите пятимиллиметровые полоски кожи или эпидермис/папиллярную дерму с эпидермисом, обращенным вверх, в чашку Петри с 10 миллилитров диссоциирующего ферментного раствора. Затем инкубировать чашку Петри при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. После инкубации перенесите эпидермис/папиллярную дерму на крышку чашки Петри.

Отделить эпидермис от верхней дермы с двумя типсами, каждый из которых держит край дермы. Впоследствии, фарш каждого дермального слоя как можно тщательнее. Чем меньше кусочки, тем лучше пищеварение тканей.

Затем приготовьте смесь пищеварения. Перенесите рубленую ткань с 10 миллиметрами подготовленной смеси пищеварения в 50-миллиметровую трубку. Инкубировать ткани при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа под возбуждение.

Переверните трубку несколько раз во время пищеварения. Чтобы подготовить одноклеточную суспензию, прекратите переваривание энзиматической ткани, добавив 10 миллилитров фибробластовой среды в переваренную ткань на льду. Затем налейте содержимое каждой трубки через обычный стерильный нержавеющий чай ситечко, и собирать подвеску клетки в чистой чашке Петри.

Вымойте ситечко со средним, и пюре непереваренных частей ткани с краем шприца поршень. После этого пипетка собрала подвеску клетки через 70-микрометровый клеточный ситечко в 50-миллилитровую трубку. Промыть ситечко клетки со средним, и собирать поток через ту же трубку.

Затем центрифуга трубки при 500 раз г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Удалите супернатант и вымойте клеточные гранулы пятью миллилитров фибробластовой среды. Повторите шаг центрифугации еще раз.

После этого удалите супернатант и повторно снимите гранулы в один миллилитр буфера эритроцитов ACK. Оставьте клетки в буфере лиза примерно на одну минуту при температуре окружающей среды. Затем, остановитьлиз, добавив девять миллилитров 1x PBS с 10%FCS.

Центрифуга трубки снова в 500 раз г при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут, и отказаться от супернатанта впоследствии. После того, как клетки были окрашены для сортировки FAC следующие стандартные протоколы, сортировать три фибробластов субпопуляции в отдельные микроцентрифуг трубки заполнены либо с 350 микролитров лиза буфера для изоляции РНК или 350 микролитров фибробластовой среды роста для клеточной культуры. Инвертировать трубы немедленно, и либо положить лиза буферных труб в жидкий азот, или положить фибробласта роста средних труб на льду.

После FACS, спина клетки вниз на 500 раз g в течение трех минут при четырех градусах по Цельсию. Затем, пластины равное количество клеток в фибробластовой среды роста в 24-хорошо клеточной культуры блюдо, и оставить их расти, пока они не достигнут 70% слияния. Затем замените культурную клеточную среду средой дифференциации адипоцитов и дайте клеткам продифференцироваться в течение 14 дней.

При дифференциации день 14, исправить клетки с 4%PFA в течение 20 минут. Вымойте скважины 60%изопропанолом, и дайте ему полностью испариться. Затем, пятно клеток с пятью миллимоларами фильтрованного масла Red O в течение 20 минут.

Через 20 минут промойте окрашенные клетки четыре раза дистиллированной водой. Изображение клеток, погруженных в воду с перевернутым микроскопом при 10-м увеличении с передаваемым светом. Этот протокол позволяет идентифицировать три популяции фибробластов в коже человека, что представляет собой различную интрадерматальную локализацию, профили экспрессии генов и функции.

FAP-положительный CD90-отрицательный обогащены в сосочковой дерме, в то время как FAP-положительный CD90-положительный и FAP-отрицательный CD90-положительный более обильны в ретикулярной дерме. Все три отсортированы субпопуляции отображения типичных фибробластов морфологии на культуру в течение семи дней. Интересно, что они ведут себя по-разному в анализе адипогенза.

После 14 дней в культуре, FAP-положительный CD90-отрицательный не дифференцируются в адипоциты, в то время как FAP-положительный CD90-положительный и FAP-отрицательный CD90-положительный легко проходят адипогенез. Профилирование экспрессии генов показывает, что FAP-положительные CD90-отрицательные клетки выражают высокий уровень маркеров, обычно приписываемых папиллярным фибробластам, таким как CD26, NTN и PDPN, в то время как CD90-положительные клетки выражают известные ретикулярные маркеры, такие как CD36, гладкий актин мышц и PPAR-гамма на высоких уровнях. Мы приходим к выводу, что FAP-положительные CD90-отрицательные клетки принадлежат к сосочковой и CD90-положительной клетки принадлежат к ретикулярной линии.

Пищеварение работает лучше всего, если кожные кусочки тщательно фарш и инкубируется в достаточном количестве пищеварения среды. Дермальные фибробластые подмножества функционально разнообразны. Изучение их функции в контексте патогенеза болезни проложит путь для новых диагностических и терапевтических вмешательств.