Name: Rilevamento del cancro ovarico utilizzando la citometria a flusso fotoacustico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Scopri la citometria a flusso fotoacustica per il rilevamento del cancro ovarico utilizzando nanoparticelle di solfuro di rame rivestite con acido folico. Questo metodo offre una piattaforma specifica e a basso costo per l'analisi dei campioni di sangue.

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Gli autori vorrebbero riconoscere Madeleine Howell per il suo aiuto con la sintesi, Matthew Chest per il suo aiuto nella progettazione del sistema di flusso e Ethan Marschall per l'assistenza con SolidWorks.

1. Sintesi e funzionalizzazione delle nanoparticelle
NOTA: la sintesi degli NP FA-CuS si ottiene utilizzando un metodo di sintesi a un piatto adattato da un protocollo pubblicato in precedenza21. AVVISO: Tutta la sintesi dovrebbe avvenire in una cappa di fumi chimici ventilata.
<ol><li>Prima della sintesi, filtrare circa 300 mL di acqua deionizzata (DI) attraverso un filtro sterile di 0,2 m.</li>
	<li>Pulire un pallone rotondo in vetro da 250 mL con una soluzione detergente e risciacquare con acqua DI. Aggiungere 0,0134 g di CuCl2 in 100 mL di acqua DI per creare una soluzione da 1 mM.</li>
	<li>Aggiungere 0,015 g di acido folico (FA) alla soluzione CuCl2 e mescolare per 5 min utilizzando una barra di stiring magnetico.</li>
	<li>Aggiungere Na2S-9H2O (0,024 g in 100 gradi l'acqua DI) su circa 10 s alla miscela di reazione utilizzando una pipetta da 200 ll. NOTA: Dopo l'aggiunta del Na2S-9H2O, la soluzione cambierà colore da un giallo chiaro a un marrone scuro.</li>
	<li>Anteporre la reazione e mettere in un bagno d'olio, impostare a 90 gradi centigradi, e continuare a mescolare con una barra di agitazione magnetica. Dopo circa 15 min, o quando il bagno d'olio ha raggiunto 85-90 gradi centigradi, permetterà alla reazione di procedere per un'ora supplementare. La miscela dovrebbe gradualmente trasformarsi in un colore verde scuro. NOTA: Assicurarsi di sfiatare il sistema durante il riscaldamento della miscela di reazione per evitare l'accumulo di pressione.</li>
	<li>Rimuovere il recipiente di reazione dal bagno d'olio e raffreddare brevemente a temperatura ambiente per circa 10-15 min prima di passare a un bagno di ghiaccio.</li>
	<li>Una volta che la miscela di reazione si è raffreddata al di sotto dei 20 gradi centigradi, regolare il pH a 10 utilizzando 1M NaOH per sciogliere l'acido folico rimanente in soluzione.</li>
	<li>Purificare la miscela di reazione FA-CuS utilizzando una colonna di centrifugazione 30 kDa. Aggiungere la soluzione in lotti da 15 mL alla colonna e centrifugare a 3.082 x g per 15 min.</li>
	<li>Una volta concentrata tutta la miscela di reazione, ricombinare le frazioni concentrate e lavare 4x con 15 mL di pH 10 NaOH nella colonna di centrifugazione 30 kDa.</li>
	<li>Per le misurazioni di massa, prendere 1/3 della soluzione (66 dollari l) e dividere in tre fiale di vetro. Asciugare in forno sottovuoto sotto vuoto di 27 mmHg.</li>
	<li>Sciogliere l'altro 2/3 della soluzione concentrata in 250 gradi di PBS e conservare a 4 gradi centigradi fino a un ulteriore utilizzo.</li>
	<li>Prima di utilizzare gli NP FA-CuS, sonoroarli per 30 minuti in un sonicatore da bagno su un ambiente elevato.</li>
</ol>2. Caratterizzazione NP
<ol><li>Eseguire la dispersione dinamica della luce (DLS) Aggiungere 10 -L di FA-CuS NPS concentrato in soluzione PBS dal punto 1.1.14 a 2 mL di acqua DI. Prima della caratterizzazione da parte delle DLS, sonicare le particelle per 30 minuti in un sonicatore da bagno su un'impostazione alta e filtrare attraverso un filtro sterile da 0,2 m per rimuovere la polvere residua.</li>
	<li>Eseguire la microscopia elettronica di trasmissione (TEM): Aggiungere 10 -L di FA-CuS NPS concentrato in soluzione PBS a un pezzo di carta cerata. Invertire una griglia di rame rivestita formvar sulla parte superiore della goccia e lasciare spalare per 2 min. Toccare il bordo della griglia rivestita di formvar per un pezzo di carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso. Lasciare asciugare l'aria. Immagine della griglia di rame che utilizza un microscopio elettronico ad una tensione accelerata di 80 kV. NOTA: i risultati tipici della caratterizzazione dei criteri di rete FA-CuS sono presentati nella Figura 1.</li>
</ol>3. Cultura cellulare
<ol><li>Questo protocollo utilizza le cellule SKOV-3. Se non diversamente specificato, colture cellule SKOV-3 nel medio 5A di McCoy integrato con 10% FBS, 100 U/mL penicillina, e 100 streptomicino di g/mL, e mantenere a 37 gradi centigradi in un umidito 5% CO2 incubatore.</li>
</ol>4. Tagging fluorescente di FA-CuS NPS per la microscopia
<ol><li>Aggiungere Texas-Red-X succinimidyl ester (0,2 mg sciolto in DMSO ad una concentrazione di 10 mg/mL) a una soluzione contenente 2 mg di NP FA-CuS in 1 mL di 0,1 M NaHCO3 (pH 9) tampone.</li>
	<li>Mescolare la miscela di reazione utilizzando una barra di agitazione magnetica per 1 h, lontano dalla luce a temperatura ambiente.</li>
	<li>Concentrare la miscela di reazione in una colonna di centrifugazione MWCO da 4 mL da 30 kDa mWCO ruotando a 4.000 x g per 10 min.</li>
	<li>Lavare la soluzione concentrata 3x con 4 mL di buffer NaHCO3 da 0,1 M (pH 9) in una colonna di centrifugazione. Successivamente, lavare la soluzione concentrata con 4 mL di acqua DI 3x o fino a quando solo una traccia di fluorescenza rimane visibile nel flusso attraverso UV-VIS.</li>
</ol>5. FA-CuS NPS Assorbimento da cellule tumorali ovariche
<ol><li>Prima dell'incubazione con gli NP FA-CuS, incubare le cellule SKOV-3 in un flacone T75 con 8-15 mL di mpMI-1640 senza acido folico con 10% FBS e 1% penicillina /streptomicina per almeno 24 h.</li>
	<li>Le cellule di semi in 0,5 mL di RPMI-1640 senza acido folico completano il supporto di crescita ad una densità di 0,1 x 106 cellule / mL in una piastra di 24 pozzetti.</li>
	<li>Il giorno seguente, incubare le cellule con 400 g/mL FA-CuS NPS in 0,5 mL di RPMI-1640 senza acido folico per 2 h.</li>
	<li>A seguito di questa incubazione, provare le cellule con 0.5 mL di 0.25% trypsin con EDTA. Aggiungere almeno 1 mL di RPMI-1640 senza acido folico per neutralizzare la prova e centrifugare le cellule a 123 x g per 6 min.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante, riutilizzare le cellule in 2 mL di PBS e centrifugare a 123 x g per 6 min. Eseguire questo passaggio di lavaggio 2x per rimuovere eventuali NP non associati.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 1-2 mL di PBS con soluzione 2% Tween.</li>
	<li>Contare le cellule utilizzando un emocitometro e trypan blu. Diluire ulteriormente le cellule se i conteggi delle cellule sono troppo alti. Diluire le cellule in PBS con 2% Tween alla concentrazione scelta per il rilevamento.</li>
	<li>Le cellule sono ora pronte per essere analizzate dal sistema PAFC.</li>
</ol>6. Microscopia a fluorescenza dell'assorbimento di FA-CuS NPS
<ol><li>Ripetere i passaggi elencati nel passaggio 5.1 e procedere con il protocollo riportato di seguito per la microscopia.</li>
	<li>Le cellule di semi ad una densità di 0,1 x 106 cellule/mL in 0,5 mL di RPMI-1640 senza acido folico completa su vetro si ripercano in una piastra di 24 pozzetti.</li>
	<li>Il giorno seguente, incubare le cellule con TAG fluorescenti FA-CuS IN triplice, a concentrazioni di 100 g/mL, 200 g/mL, 300 g/mL e 400 g/mL in 0,5 mL di foglia di RPMI-1640 senza acido.</li>
	<li>Incubare le cellule con le NP per 2 h nell'incubatrice a 37</li>
	<li>Dopo questo periodo di incubazione, lavare le cellule 3x con PBS. NOTA: Per tutte le fasi di lavaggio, aggiungere con attenzione la soluzione sul lato della piastra del pozzo per non disturbare le cellule. Dopo l'aggiunta, inclinare con attenzione la piastra e ritirare la soluzione dal lato del pozzo.</li>
	<li>Incubare le cellule con 0,5 mL di 3,7% paraformaldeide (PFA) in PBS per 15 min e trasferire i coperchi di vetro in una nuova piastra di 24 pozzetti. PRUDENTE: PFA è un cancerogeno noto. Eseguire tutte le fissazioni in una cappa di fumi chimici ventilata e indossare adeguati dispositivi di protezione personale.</li>
	<li>Incubare le cellule in una soluzione del 3,7% di PFA con 0,1% Triton-X in PBS per 5 min.</li>
	<li>Lavare le celle con 0,5 mL di PBS 3x per 5 min ciascuna e trasferire i copricopertine in una nuova piastra.</li>
	<li>Incubare le cellule con 0,5 mL di una soluzione PBS contenente DAPI (20 l/mL di una soluzione di riserva di 0,5 mg/mL viene utilizzato per la colorazione) per 5 minuti, lontano dalla luce.</li>
	<li>Lavare le cellule con PBS 3x.</li>
	<li>Dopo il lavaggio PBS finale, montare i copricopre sui vetrini con supporto di montaggio.</li>
	<li>Le cellule sono ora pronte per essere immagini mediante microscopia a fluorescenza. La figura 2 mostra un esempio di caratterizzazione cellulare tipica mediante microscopia a fluorescenza.</li>
</ol>7. Architettura del sistema di flusso
<ol><li>Costruzione della camera di flusso NOTA:Un file SolidWorks di un serbatoio di flusso stampato in 3D è disponibile nei materiali supplementari.<ol>
<li>Utilizzando il file SolidWorks fornito, stampare in 3D il serbatoio di flusso utilizzando la termoplastica ABS o la plastica PLA. Le dimensioni sono fornite di seguito se SolidWorks non è disponibile. Figura 3A Mostra una rappresentazione di questo modello. Il corpo del serbatoio di flusso è 2,5 cm x 1,5 cm x 7,5 cm. Le estremità finali del serbatoio di flusso includono fori di circa 5 mm di diametro per consentire l'ingresso di tubi contenenti il tubo capillare. NOTA: Il serbatoio di flusso ha un foro di 1 cm, perpendicolare all'orientamento del tubo capillare, per il posizionamento del trasduttore ad ultrasuoni. Un'estrusione cilindrica con lo stesso diametro interno del foro si estende per 6 mm nel serbatoio. Per l'imaging in tempo reale, il serbatoio di flusso ha uno slot da 1 mm x 3 mm direttamente sotto il tubo capillare.</li>
		<li>Dopo aver stampato il serbatoio di flusso 3D, pulire e assemblare il sistema per l'uso.</li>
		<li>Posizionare le coperture in vetro sopra lo slot di 1 mm x 3 mm e il foro di 1 cm nel sistema di flusso.</li>
		<li>Sigillare con attenzione con silicone per evitare perdite.</li>
		<li>Montare il tubo capillare nei tubi curati in silicone. Inserire i tubi nella camera di flusso attraverso il lato del serbatoio di flusso in modo che il tubo capillare di vetro è direttamente sopra e davanti allo slot 3 mm e il foro di 1 cm.</li>
		<li>Sigillare i tubi con silicone per evitare perdite.</li>
	</ol></li>
	<li>Configurazione del sistema di flusso fotoacustico NOTA: figura 3B e Figura 3C mostrano un esempio dell'architettura del sistema di flusso.<ol>
<li>Collegare il trasduttore a un pulsatore/ricevitore a ultrasuoni. Amplifica il segnale con un guadagno di 59 dB.</li>
		<li>Collegare l'output del filtro a un oscilloscopio riconfigurabile multiuso dotato di un array di cancelli programmabili da campo integrato.</li>
		<li>Collegare uno dei tubi provenienti dalla camera di flusso ad una giunzione a T, collegata a due pompe di siringhe ad ogni ramo.</li>
		<li>Riempire una delle pompe di siringhe con aria e l'altra pompa con il campione da analizzare. Impostare la pompa contenente aria su una portata di 40 l/min e la pompa contenente il campione fino a una portata di 20 l/min. Il flusso in due fasi risultante produrrà volumi campione di 1 L. A questa portata, il sistema testerà circa 6,4 campioni al minuto. NOTA: Per mantenere una distribuzione coerente delle cellule, vorticare leggermente ogni campione immediatamente prima di essere testato. Inoltre, ruotare la siringa ogni pochi minuti per evitare che le cellule si stabiliscano nella soluzione.</li>
		<li>Collegare il tubo rimanente in uscita dal sistema di flusso a un contenitore con 10% candeggina, per smaltire le cellule dopo l'uscita dal sistema di flusso. NOTA: prima di utilizzare il sistema di flusso, verificare la presenza di perdite, in quanto queste possono influire sul flusso. Le cellule devono essere contenute all'interno di un sistema chiuso per mantenere la sicurezza biologica durante la procedura.</li>
		<li>Il design del serbatoio stampato in 3D consente un allineamento coerente e ripetibile tra il trasduttore e la luce laser con una calibrazione minima. Se posizionato correttamente all'interno del serbatoio personalizzato, il tubo capillare al quarzo assicura che il trasduttore e il laser siano allineati direttamente.</li>
		<li>Posizionare la sezione del tubo capillare al quarzo in allineamento diretto con il trasduttore, nel campo visivo del microscopio, consentendo un attento posizionamento della fibra ottica sopra il campione in modo da illuminare l'intera larghezza del tubo.</li>
		<li>Irradiare il campione utilizzando una fibra ottica che incanala un laser a stato solido pompato a diodo che opera ad una lunghezza d'onda di 1.053 nm. L'incidente della luce laser sul campione e sul trasduttore utilizzato per misurare l'effetto fotoacustico non è stato focalizzato.</li>
		<li>L'energia dell'incidente laser sul campione è di circa 8 mJ e la velocità laser a 10 Hz è sufficiente per illuminare ogni campione più volte mentre passa attraverso il sistema.</li>
		<li>Posizionare il sistema di flusso su un microscopio invertito e assicurarsi che sia l'impulso laser che il percorso del campione siano visibili man mano che il campione passa attraverso il sistema di flusso. Registrare il flusso utilizzando una telecamera montata al microscopio.</li>
		<li>Registrare le acquisizioni di ultrasuoni utilizzando il software di acquisizione dei dati (vedere Tabella dei materiali). Attivare ultrasuoni e laser pulsato utilizzando l'FPGA. Utilizzare PBS con 2% Tween e GLI NP FA-CuS a una concentrazione di 100 g/mL in PBS 2% Tween, rispettivamente come controlli negativi e positivi.</li>
		<li>Utilizzando una telecamera montata al microscopio, registrare sia la cottura del laser che il passaggio dei campioni attraverso il sistema di flusso. Queste registrazioni saranno utilizzate per correlare il segnale acustico registrato dal trasduttore con la cottura del laser. Quando i campioni passano davanti alla cottura del laser, il segnale può quindi essere correlato al segnale fotoacustico risultante per l'analisi. Ad una velocità di campionamento di 10 Hz, il laser illuminerà ogni spina più volte.</li>
	</ol></li>
</ol>8. Post-elaborazione
<ol><li>Per ogni acquisizione del segnale, s(t), calcolare la trasformazione Hilbert, H[s(t)], al fine di creare un segnale analitico.</li>
	<li>Creare un involucro complesso, se(t), calcolando la grandezza <img src="/files/ftp_upload/60279/60279eq1.jpg"> del segnale analitico, in modo tale da integrare l'involucro per misurare il segnale totale risultante da ogni acquisizione. Confrontare i segnali di ogni gruppo di test (ad esempio PBS, celle con tag, NP FA-CuS, sole cellule) utilizzando un test t nel software statistico R. I segnali fotoacustici grezzi e le loro trasformazioni di Hilbert sono presentati nella Figura 4.</li>
	<li>Per la ricostruzione dell'immagine, normalizzare l'inviluppo complesso in base al picco massimo dell'intera conduzione. Se si confronta una serie di condutture, normalizzare l'involucro complesso utilizzando il picco massimo dell'intera serie. Dopo la normalizzazione, converti ogni acquisizione in una serie di valori di pixel. Rappresenta ogni serie di valori di pixel come colonna nella ricostruzione dell'immagine. Le ricostruzioni rappresentative di PBS e dei segnali NP FA-CuS sono mostrate nella Figura 5, dove entrambe le immagini sono state normalizzate utilizzando il picco massimo in entrambe le esecuzioni.</li>
</ol>

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<li>Blassl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+single+circulating+tumor+cells+in+ovarian+cancer-Establishment+of+a+multi-marker+gene+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of single circulating tumor cells in ovarian cancer-Establishment of a multi-marker gene panel.</a> Molecular Oncology. 10 (7), 1030-1042 (2016).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+living+circulating+tumor+cells+in+patients+by+immunomagnetic+negative+enrichment+coupled+with+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of living circulating tumor cells in patients by immunomagnetic negative enrichment coupled with flow cytometry.</a> Cancer. 121 (17), 3036-3045 (2015).</li>
<li>Bhattacharyya, K., Goldschmidt, B. S., Viator, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+capture+of+breast+cancer+cells+with+photoacoustic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Detection and capture of breast cancer cells with photoacoustic flow cytometry.</a> Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 087007(2016).</li>
<li>Zharov, V. P., Galanzha, E. I., Shashkov, E. V., Khlebtsov, N. G., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+monitoring+of+circulating+single+cancer+cells+and+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo photoacoustic flow cytometry for monitoring of circulating single cancer cells and contrast agents.</a> Optics Letters. 31 (24), 3623-3625 (2006).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+liquid+biopsy+using+Cytophone+platform+for+photoacoustic+detection+of+circulating+tumor+cells+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo liquid biopsy using Cytophone platform for photoacoustic detection of circulating tumor cells in patients with melanoma.</a> Science Translational Medicine. 11 (496), eaat5857(2019).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photoacoustic+flow+cytometry+for+early+malaria+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">In vivo photoacoustic flow cytometry for early malaria diagnosis.</a> Cytometry Part A. 89 (6), 531-542 (2016).</li>
<li>Galanzha, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+magnetic+enrichment+and+multiplex+photoacoustic+detection+of+circulating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells.</a> Nature Nanotechnology. 4 (12), 855(2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo è un metodo semplice per il rilevamento di TIC ovarici che utilizzano PAFC e un agente di contrasto CuS mirato. Sono stati esplorati molti metodi per il rilevamento di CTC ovarici, tra cui dispositivi microfluidici, RT-PCR e citometria del flusso di fluorescenza23,24,25. Questi variano in complessità, costi e precisione, limitando la loro efficacia in ambienti clinici. PAFC introduce diversi vantaggi rispetto a...

Il cancro ovarico è una delle neoplasie ginecologiche più letali e ha provocato circa 184.800 decessi in tutto il mondo nel 20181. Studi multipli hanno dimostrato la correlazione tra la progressione del cancro ovarico (cioè la metastasi) e la presenza di CTC2,3,4. Il metodo più comune per il rilevamento e l'isolamento dei CTC utilizza il sistema Cellsearch, che si rivolge al recettore EpCam5. L'espressione EpCam, tuttavia, è downregolata nella transizione epiteliale a mesenchymic, che è stata implicata nella metastasi del cancro6. Nonostante i progressi compiuti, le attuali tecnologie cliniche soffrono ancora di bassa precisione, costi elevati e complessità. A causa di questi inconvenienti, le nuove tecnologie per la scoperta e l'enumerazione dei CTC ovarici sono diventate un'area importante per la ricerca.
Recentemente, il PAFC è emerso come un metodo efficace per la rilevazione non invasiva delle cellule tumorali, l'analisi dei nanomateriali e l'identificazione dei batteri7,8,9. IL PAFC differisce dalla tradizionale citometria del flusso di fluorescenza rilevando gli analiti nel flusso utilizzando la fotoacustica. L'effetto fotoacustico viene generato quando la luce laser viene assorbita da un materiale che causa l'espansione termoelastica, producendo un'onda acustica che può essere rilevata da un trasduttore ad ultrasuoni10,11. I vantaggi del PAFC rispetto ai metodi tradizionali di citometria di flusso includono semplicità, facilità di traduzione in ambienti clinici e il rilevamento di CTC a profondità senza precedenti nei campioni dei pazienti12,13. Recenti studi hanno utilizzato sistemi PAFC per il rilevamento delle cellule utilizzando contrasto endogeno ed esogeno14,15. Gli agenti di contrasto ad assorbimento della luce vicino all'infrarosso (NIR) come il colorante verde indocianina e gli NP metallici (ad esempio oro e CuS) sono stati utilizzati per l'etichettatura selettiva di cellule e tessuti in combinazione con l'imaging fotoacustico16,17,18. A causa della migliore profondità di penetrazione della luce NIR all'interno dei tessuti biologici, il rilevamento fotoacustico degli assorbitori può essere eseguito a maggiori profondità per le applicazioni cliniche. A causa del suo grande potenziale di utilizzo nella clinica, la combinazione di agenti di contrasto NIR mirati con PAFC ha generato un notevole interesse per il rilevamento dei CTC.
IL PAFC in combinazione con agenti a contrasto mirati fornisce un approccio migliorato per l'analisi ad alta velocità dei campioni dei pazienti con maggiore precisione e rilevamento mirato dei CTC. Una delle principali strategie di rilevamento per i CTC è il targeting specifico delle proteine della membrana presenti sulla cellula di interesse. Una caratteristica notevole dei CTC ovarici è la sovraespressione dei recettori del folato situati sulla loro membrana esterna19. Il targeting del recettore del folato è una strategia ideale per l'identificazione dei CTC ovarici nel sangue perché le cellule endogene, che hanno una maggiore espressione dei recettori degli acidi folichi, sono generalmente luminose e hanno un'esposizione limitata al flusso sanguigno20. Gli NP di solfuro di rame (CUS NP) sono stati recentemente riconosciuti per la loro capacità di indirizzare i recettori del folato espressi sulle cellule cancerose21. In combinazione con la loro biocompatibilità, facilità di sintesi e assorbimento in profondità nella NIR, questi agenti di contrasto NP fanno una strategia di targeting ideale per il rilevamento di TIC ovarici che utilizzano il PAFC.
Questo lavoro descrive la preparazione degli NP FA-CuS e il loro utilizzo per il rilevamento delle cellule tumorali ovariche in un sistema di flusso fotoacustico. Gli NP CuS sono modificati con acido folico per indirizzare specificamente CTC ovarici ed emettono un segnale fotoacustico quando stimolati con un laser da 1.053 nm. I risultati indicano il successo del rilevamento di cellule tumorali ovariche incubate con questi agenti di contrasto fotoacustico all'interno del sistema PAFC. Questi risultati mostrano il rilevamento delle cellule tumorali ovariche fino a concentrazioni di 1 cellula/L, e la microscopia a fluorescenza conferma l'assorbimento di successo di queste particelle da parte delle cellule tumorali ovariche SKOV-322. Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata della sintesi degli NP FA-CuS, la preparazione di campioni per la microscopia a fluorescenza, la costruzione del sistema a flusso fotoacustico e il rilevamento fotoacustico delle cellule tumorali ovariche. Il metodo presentato mostra una corretta identificazione dei CTC ovarici nel flusso che utilizzano gli NP FA-CuS. Il lavoro futuro si concentrerà sull'applicazione clinica di questa tecnologia verso la diagnosi precoce delle metastasi del cancro ovarico.

<table><tbody><tr><td>0,025% tripsina con EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &; m 1.000 mL Unità di filtrazione sottovuoto</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td>Per filtrare grandi volumi di acqua deionizzata.</td></tr><tr><td>0,2 &micro; m filtro per siringa sterile</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio</td><td></td> stampato in 3D Scheda di acquisizione <td>personalizzata</td><td></td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>PXIe-5170R</td><td>250 MS/s, 8 canali, 14 bit</td></tr><tr><td>Alconox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242985-1.8KG</td><td>Detergente utilizzato per la pulizia della vetreria.</td></tr><tr><td>Filtri centrifughi Amicon Ultra-15</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Filtri centrifughi Amicon Ultra-4</td><td>Ematocitometro Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di rame (II)</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>206532500</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo di accoppiamento</td><td>Thorlabs</td><td>LMH-10x-532</td><td>Accoppiare luce pulsata su fibra ottica.</td></tr><tr><td>Stadio di accoppiamento</td><td>Newport</td><td>F-91-C1-T</td><td>Stadio per l'accoppiamento della luce pulsata all'obiettivo. Contiene il bagno di pulizia digitale a ultrasuoni FP-1A e LMH-10x-532</td></tr><tr><td>serie CPX Fisherbrand</td><td></td><td>Model CPX3800</td><td></td></tr><tr><td>Software di acquisizione dati</td><td>National Instruments</td><td>NI LabVIEW 2017 (32-bit)</td><td>LabVIEW utilizzato per sincronizzare gli impulsi laser con l'acquisizione dei dati.</td></tr><tr><td>Software di elaborazione dati</td><td>Mathworks</td><td>Matlab R2016a</td><td>Ricostruzioni e grafici prodotti con il software Matlab.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fibra Mandrino</td><td>Newport</td><td>FPH-DJ</td><td>Utilizzato per trattenere la fibra nuda.</td></tr><tr><td>Accoppiatore in fibra</td><td>Newport</td><td>FP-1A</td><td>Tavolino a 3 assi per il posizionamento del mandrino in fibra e della fibra ottica al centro dell'obiettivo.</td></tr><tr><td>Acido folico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7876-10G</td><td></td></tr><tr><td>Griglie TEM rivestite Formvar</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>FCF300-CU-SB</td><td></td></tr><tr><td>Tubi Masterflex</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-96420-14</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2007</td><td></td></tr><tr><td>Norm-Ject 10 mL Siringhe</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>4100-X00V0</td><td></td></tr><tr><td>Fibra ottica</td><td>Thorlabs</td><td>FG550LEC</td><td>Utilizzato per esporre il campione alla luce pulsata.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62036</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Laser pulsato</td><td>RPMC Lasers Inc</td><td>Quantus-Q1D-1053</td><td>Sorgente laser pulsata con specifiche 1053 nm, impulso 8 ns, 10 Hz massimo.</td></tr><tr><td>Pulsatore/Ricevitore</td><td>Olympus</td><td>5077PR</td><td>Riceve, filtra e amplifica i segnali fotoacustici. Funziona con un guadagno di 59 dB.</td></tr><tr><td>Tubo capillare al quarzo</td><td>Strumento Sutter</td><td>QF150-75-10</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Midum 1640 (1x) Senza acido folico</td><td>Gibco</td><td>27016-021</td><td></td></tr><tr><td>Silicone</td><td>Momentive Performance Materials, Inc.</td><td>GE284</td><td></td></tr><tr><td>SKOV-3 Celle</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7795-500G</td><td></td></tr><tr><td>Perle di idrossido di sodio</td><td>BDH</td><td>BDH9292-500G</td><td></td></tr><tr><td>Solfuro di sodio nonaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431648-50G</td><td></td></tr><tr><td>Pompe a siringa</td><td>New Era Pump Systems Inc</td><td>DUAL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X-Succinimydl ester</td><td>Invitrogen</td><td>1949071</td><td></td></tr><tr><td>Transducer</td><td>Olynmpus</td><td>V214-BB-RM</td><td>Rivelatore a ultrasuoni con frequenza centrale di 50 MHz e larghezza di banda frazionaria di -6 dB dell'82%.</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution 0,4%</td><td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gel per ultrasuoni</td><td>Parker Laboratories Inc.</td><td>Aquasonic 100</td><td>Gel per ultrasuoni per l'accoppiamento del trasduttore</td></tr></tbody></table>

rilevamento del cancro ovarico utilizzando la citometria a flusso fotoacustico

Ovarian Cancer Detection Using Photoacoustic Flow Cytometry

Molti studi suggeriscono che l'enumerazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) può mostrare promessa come strumento prognostico per il cancro ovarico. Le strategie attuali per il rilevamento dei CTC includono la citometria di flusso, i dispositivi microfluidici e la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR). Nonostante i recenti progressi, i metodi per la rilevazione delle metastasi del cancro ovarico precoce mancano ancora della sensibilità e della specificità necessarie per la traduzione clinica. Qui, viene presentato un nuovo metodo per la rilevazione di cellule tumorali circolanti ovariche da citometria a flusso fotoacustica (PAFC) utilizzando un sistema stampato tridimensionale personalizzato (3D), tra cui una camera di flusso e una pompa di siringhe. Questo metodo utilizza nanoparticelle di solfuro di rame con controllo acido folico (FA-CuS NP) per indirizzare le cellule tumorali ovariche SKOV-3 da PAFC. Questo lavoro dimostra l'affinità di questi agenti di contrasto per le cellule tumorali ovariche. I risultati mostrano la caratterizzazione NP, il rilevamento PAFC e l'assorbimento di NP mediante microscopia a fluorescenza, dimostrando così il potenziale di questo nuovo sistema per rilevare i CTC ovarici a concentrazioni fisiologicamente rilevanti.

La figura 1A mostra una tipica immagine TEM delle nanoparticelle sintetizzate. La dimensione media della nanoparticella tipica è di circa 8,6 nm e 2,5 nm. La misurazione delle nanoparticelle è stata eseguita in ImageJ. Sono state applicate funzioni di soglia e spartiacque per separare le particelle per la misurazione. I diametri orizzontali e verticali di ogni particella sono stati misurati perpendicolarmente l'uno all'altro e ulteriormente m...

Viene presentato un protocollo per rilevare le cellule tumorali ovariche circolanti utilizzando un sistema di flusso fotoacustico su misura e nanoparticelle di solfuro di rame con cofano con clofatura di acido folico mirati.

Rilevamento del cancro ovarico utilizzando la citometria a flusso fotoacustico

Many studies suggest that the enumeration of circulating tumor cells (CTCs) may show promise as a prognostic tool for ovarian cancer. Current strategies ...

Le attuali misure cliniche di rilevamento del cancro alle ovaie sono aspecifiche e mancano di rilevamento del punto di cura delle cellule tumorali circolanti. Il nostro sistema di flusso fotoacustico consente di testare campioni di pazienti per specifici marcatori di cancro alle ovaie nel flusso sanguigno. Questa procedura fornisce una tecnologia di piattaforma unica con miglioramenti rispetto alle tecniche attuali in termini di semplicità, basso costo, limiti promettenti di rilevamento e capacità di essere applicata ad applicazioni generali.Attraverso questo lavoro, miriamo a costruire il nostro sistema di nanoparticelle mirate per il cancro alle ovaie per testare campioni di pazienti ex vivo per cTC. Questo sistema PAFC altamente versatile è in grado di espandersi per uso clinico, testando la presenza di una vasta gamma di biomarcatori nel sangue. Un corretto allineamento ottico è fondamentale per il rilevamento di bersagli all'interno del sistema di citometria a flusso fotoacustico.Inoltre, per garantire un corretto accoppiamento acustico, assicurarsi che non vi siano bolle tra il vetrino e il trasduttore. A causa della natura personalizzata del sistema di flusso e dei suoi componenti, la visualizzazione del metodo è utile per una riproduzione accurata. In una cappa aspirante chimica ventilata, filtrare circa 300 millilitri di acqua deionizzata attraverso un filtro sterile da 0,2 micrometri.Aggiungere 0,0134 grammi di cloruro di rame e 100 millilitri di acqua deionizzata a un pallone inferiore rotondo pulito da 250 millilitri per creare una soluzione di cloruro di rame millimolare. Aggiungere 0,015 grammi di acido folico al pallone e utilizzare una barra di agitazione magnetica per mescolare la soluzione per circa cinque minuti. Quindi mescolare 0,024 grammi di solfuro di sodio nonaidrato con 100 microlitri di acqua deionizzata.Utilizzare una pipetta da 200 microliter per aggiungere lentamente questa soluzione alla miscela di reazione per una durata di circa 10 secondi. Cap il recipiente di reazione. Posizionare la nave in un bagno d'olio impostato a 90 gradi Celsius e continuare a mescolare.Dopo circa 15 minuti o quando il bagno d'olio ha raggiunto l'intervallo di temperatura compreso tra 85 e 90 gradi Celsius, consentire alla reazione di procedere per un'ora aggiuntiva. Al termine della reazione, rimuovere il recipiente di reazione dal bagno d'olio e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente per 10-15 minuti prima di trasferirlo in un bagno di ghiaccio. Una volta raffreddata la reazione, regolare il pH a circa 10 utilizzando un idrossido di sodio molare.Aggiungere la miscela a una colonna di centrifugazione di 30 kilodalton in lotti da 15 millilitri e centrifugare a 3.082 volte g per 15 minuti per purificare la miscela di reazione. In primo luogo, mescolare le nanoparticelle di solfuro di rame chiuso con acido folico alla giusta concentrazione nei mezzi RPMI freschi. Aggiungere questa soluzione di nanoparticelle ad ogni pozzo della piastra preparata a 24 pozzetti che contiene cellule SK-OV-3 ad una concentrazione di 400 microgrammi per millilitro.Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per due ore. Successivamente, tripinare le cellule con 0,5 millilitri dello 0,25% di tripside e EDTA. Per neutralizzare la tripsiderina, aggiungere almeno un millilitro di RPMI 1640 privo di acido folico e centrifugare le cellule a 123 volte g per sei minuti.Per lavare le cellule, rimuovere il supernatante, rimescolare le cellule in due millilitri di PBS e centrifugare a 123 volte g per sei minuti. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte per rimuovere eventuali nanoparticelle non vincolate. Quindi rimospendare le celle con uno o due millilitri di una soluzione di interpolazione del 2% in PBS.Contare le cellule usando un emocitometro e Trypan Blue. Diluire le cellule in una soluzione del 2%Tween in PBS alla concentrazione scelta per il rilevamento. Utilizzare il file STL tridimensionale fornito per stampare in 3D il serbatoio di flusso con termoplastica ABS o plastica PLA.Dopo aver stampato il serbatoio, pulire e assemblare il sistema per l'uso. Posizionare le coperture in vetro sopra lo slot di un millimetro per tre millimetri e il foro di un centimetro nel sistema di flusso e sigillare con cura con silicone per evitare perdite. Quindi, inserire il tubo capillare nei tubi polimerizzati in silicone.Inserire i tubi nella camera di flusso attraverso il lato del serbatoio di flusso in modo che il tubo capillare in vetro sia direttamente sopra e davanti alla fessura di tre millimetri e al foro di un centimetro. Sigillare il tubo con silicone. Quindi collegare il trasduttore a un pulser e ricevitore ad ultrasuoni.Amplifica il segnale con un guadagno di 59 decibel. Collegare l'output del filtro a un oscilloscopio riconfigurabile multifunzione dotato di un array di gate programmabile sul campo incorporato. Collegare uno dei tubi provenienti dalla camera di flusso a una giunzione a T collegata a due pompe per siringhe in ogni ramo.Riempire una delle pompe della siringa con aria e l'altra pompa con il campione da analizzare. Impostare la pompa contenente aria su una portata di 40 microlitri al minuto e impostare la pompa contenente il campione su una portata di 20 microlitri al minuto. Quindi, collegare il tubo rimanente che esce dal sistema di flusso a un contenitore di candeggina al 10% per smaltire le celle dopo l'uscita dal sistema di flusso.Posizionare la sezione del tubo capillare al quarzo in diretto allineamento con il trasduttore nella vista sul campo del microscopio per consentire un attento posizionamento della fibra ottica sopra il campione in modo che illumini l'intera larghezza del tubo. Irradiare il campione utilizzando una fibra ottica che incanala un laser a stato solido pompato a diodi che opera ad una lunghezza d'onda di 1.053 nanometri. Utilizzare una fotocamera montata al microscopio per registrare il flusso, la cottura del laser e il passaggio dei campioni attraverso il sistema di flusso.In questo studio, la citometria a flusso fotoacustico e l'agente mirato di targeting del solfuro di rame sono usati per rilevare le cellule tumorali circolanti ovariane. Una tipica immagine TEM delle nanoparticelle sintetizzata mostra che la dimensione media di una nanoparticella tipica è di circa 8,6 nanometri. I diametri orizzontali e verticali di ogni particella vengono quindi misurati perpendicolarmente l'uno all'altro e ulteriormente mediati.Il diametro idrodinamico medio per queste particelle è di 73,6 nanometri. Le nanoparticelle di solfuro di rame hanno una caratteristica curva di assorbanza che si estende nel vicino infrarosso. C'è un leggero manufatto di circa 850 nanometri causato dalla commutazione dei laser da parte dello spettrofotometro.Le immagini della microscopia a fluorescenza di cellule incubate con nanoparticelle contrassegnate fluorescentmente mostrano che l'assorbimento delle nanoparticelle può essere visualizzato dalla presenza di fluorescenza attraverso la cellula. Le cellule non incubate con nanoparticelle non mostrano alcun segnale fluorescente. La presenza di questo segnale fluorescente indica il successo dell'assorbimento delle particelle e la loro capacità di essere rilevate nel sistema di flusso.Esempi di segnali tipici di acquisizione dati sono mostrati qui. I dati grezzi indicano le differenze di segnale tra le nanoparticelle taggate cellule, PBS, e l'acido folico limitato nanoparticelle di solfuro di rame. Utilizzando la vista di laboratorio personalizzata e il software MATLAB, le ricostruzioni delle immagini sono fatte dei controlli positivi e negativi rispettivamente in tempo reale e dopo l'acquisizione.I singoli inviluppi vengono successivamente convertiti in valori di pixel e visualizzati come colonne indipendenti. Chiare differenze nel segnale fotoacustico si verificano tra pbs e le nanoparticelle di solfuro di rame con limitato acido folico ad una concentrazione di 100 microgrammi per millilitro. Durante questa procedura, è fondamentale allineare correttamente il trasduttore ad ultrasuoni, il microscopio e la fibra ottica all'interno del sistema di citometria a flusso fotoacustico.Confermare l'allineamento del sistema testando i controlli positivi e negativi. Grazie alla versatilità delle tecniche di targeting fotoacustico e all'ampia gamma di applicazioni possibili utilizzando PAFC, questa tecnica apre la strada ad applicazioni cliniche e di ricerca di importanza traslazionistica. Per garantire l'applicazione clinica, ulteriori studi dovrebbero concentrarsi sul test dei campioni di pazienti e sulla riduzione delle fasi procedurali.La sintesi delle nanoparticelle dovrebbe avvenire in una cappa aspirante chimica utilizzando i dispositivi di protezione adeguati. Le linee cellulari umane devono essere gestite secondo le linee guida dell'istituto. L'uso del laser richiede un addestramento alla sicurezza delle radiazioni e DPI appropriati.L'uso del laser e i test fotoacustici devono essere eseguiti solo da personale altamente qualificato.

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Abbiamo sviluppato un citofluorimetro mediante ultrasuoni laser indotto a rilevare in circolo cellule di melanoma come un indicatore precoce della malattia metastatica.

Rilevazione e isolamento delle cellule del melanoma circolanti con flussimetria fotoacustico

In questo video, dimostriamo una tecnica per facilitare l'internalizzazione delle nanoparticelle di solfuro di rame ricoperte di acido folico (NP CuS). Le NP di CuS funzionalizzate con acido folico hanno la capacità di colpire i recettori dei folati che sono sovraespressi in molte cellule di cancro ovarico.

Targeting di nanoparticelle funzionalizzate del cancro ovarico: una tecnica per facilitare l'assorbimento dell'agente di contrasto di nanoparticelle coniugato con acido folico da parte delle cellule di cancro ovarico

In questo video, presentiamo una rilevazione citometrica a flusso fotoacustica di cellule tumorali ovariche contenenti nanoparticelle in una camera a flusso circolante in vitro. Questa tecnica non invasiva identifica con successo le cellule tumorali circolanti in un sistema di flusso utilizzando un agente di contrasto.

Citometria a flusso fotoacustica in vitro: una tecnica fotoacustica a flusso non invasiva per rilevare le cellule di cancro ovarico circolanti contenenti nanoparticelle

Questo protocollo descrive una tecnica per la preparazione del campione mediante la co-coltura di espianti ovarici con le cellule tumorali delle tube di Falloppio. Questi campioni vengono visualizzati utilizzando la spettroscopia di massa per immagini, o IMS, per rilevare lo scambio di piccole molecole tra le cellule e i tessuti che porta allo sviluppo del tumore.

Modellazione della comunicazione del cancro ovarico per l'analisi della spettrometria di massa per immagini: un metodo per identificare i comunicatori chimici di piccole molecole nello sviluppo di tumori ovarici metastatici

Cistografia fotoacustico (PAC) ha un grande potenziale per mappare vesciche urinarie, una radiazione organo interno sensibile nei pazienti pediatrici, senza l'utilizzo di alcun radiazioni ionizzanti o di agente di contrasto tossico. Qui mostriamo l'utilizzo del PAC per la mappatura vesciche urinarie con una iniezione di traccianti ottici-opachi nei...

Cistografia fotoacustico

Descriviamo una piattaforma di imaging animale non invasiva che consente il rilevamento, la quantificazione e il monitoraggio della crescita e della recidiva del cancro ovarico. Questo modello di xenotrapianto intraperitoneale imita il profilo clinico delle pazienti con carcinoma ovarico.

Modello murino per l&#39;imaging non invasivo per rilevare e monitorare Ovarian Cancer Ricorrenza

Le metastasi del cancro ovarico sono caratterizzate da numerose lesioni diffuse intra-peritoneali, tali da rendere difficile un'accurata quantificazione visiva del carico tumorale.  Qui descriviamo un metodo per la quantificazione in situ ed ex vivo del carico tumorale metastatico utilizzando cellule tumorali marcate con proteina fluorescente rossa (RFP) e imaging ottico.

La quantificazione di intra-peritoneale del cancro ovarico metastasi

Qui vi presentiamo un protocollo per stimare il materiale e la superficie proprietà ottiche utilizzando l'Effetto Fotoacustico combinato con riflessione interna totale. Questa tecnica evanescenti fotoacustica sul campo basati possono essere usati per creare un sistema di metrologia fotoacustico di stimare indici di spessori, di massa e sottile rifrazione pellicola di materiali ', e di esplorare le loro proprietà ottiche.

Evanescente campo fotoacustica based: ottico valutazione delle proprietà a Surfaces

Cancro ovarico forma metastasi durante la cavità peritoneale. Qui, presentiamo un protocollo per rendere e uso folato-recettore mirati a risonanza superficie-enhanced Raman scattering nanosonde che rivelano queste lesioni con formazione immagine di alta specificità via raziometrici. Le nanosonde sono amministrati intraperitonealmente ai topi vivi, e le immagini derivate correlano bene con l'istologia.

Risonanza di superficie-enhanced Raman Scattering Nanosonda Ratiometry per la rilevazione di cancro ovarico microscopico tramite ricevitore di folato di Targeting

Riportiamo un protocollo di ecografia e imaging fotoacustico coregistrato per l'imaging transvaginale delle lesioni ovariche/annessiali. Il protocollo può essere prezioso per altri studi di imaging fotoacustico traslazionale, in particolare quelli che utilizzano array di ultrasuoni commerciali per il rilevamento di segnali fotoacustici e algoritmi standard di beamforming a distanza e somma per l'imaging.

Un protocollo di ecografia e imaging fotoacustico coregistrato per l'imaging transvaginale delle lesioni ovariche

I cambiamenti nel flusso sanguigno ovarico durante il periodo preovulatorio sono essenziali per l'ovulazione. L'ecografia Doppler è stata utilizzata nell'uomo e negli animali di grossa taglia per valutare l'emodinamica e la perfusione ovarica. Viene presentato un protocollo per l'applicazione dell'ecografia Doppler per valutare l'emodinamica ovarica durante le fasi preovulatorie e periovulatorie nei topi.

Ecografia Doppler per l'imaging dal vivo e la quantificazione della funzione vascolare ovarica nei topi

Scopri la citometria a flusso fotoacustica per il rilevamento del cancro ovarico utilizzando nanoparticelle di solfuro di rame rivestite con acido folico. Questo metodo offre una piattaforma specifica e a basso costo per l'analisi dei campioni di sangue.

Rilevamento del cancro ovarico utilizzando la citometria a flusso fotoacustico

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