Name: Una piattaforma di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) per lo studio degli enzimi biosintetici peptidici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Scopri la spettrometria di massa HDX-MS per analizzare la dinamica conformazionale delle lantipeptide sintetasi. Questo metodo bottom-up identifica regioni funzionalmente importanti senza necessità di marcatura.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, dal Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, dalla Canadian Foundation for Innovation e dai fondi di start-up della McGill University.

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<li>Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electrospray+ms-coupled+microfluidic+device+for+sub-second+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+pulse-labelling+reveals+allosteric+effects+in+enzyme+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition.</a> Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).</li>
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Non abbiamo nulla da rivelare.

Il flusso di lavoro HDX-MS presentato in questo protocollo fornisce una piattaforma straordinariamente robusta per mappare la distribuzione spaziale di elementi strutturalmente dinamici nelle proteine e per indagare come queste dinamiche cambiano in risposta alla perturbazione (legame del ligando, mutagenesi enzimatica, ecc.). L'HDX-MS presenta diversi vantaggi distinti rispetto ad altri approcci di biologia strutturale che sono comunemente usati per studiare la dinamica conformazionale. In particolare, sono necessarie s...

Le proteine sono molecole strutturalmente dinamiche che campionano diverse conformazioni su scale di tempo che vanno dalla vibrazione del legame su scala femtoseconda ai riarrangiamenti di interi domini proteici che possono verificarsiper molti secondi 1. Queste fluttuazioni conformazionali sono spesso aspetti critici della funzione enzimatica/proteica. Ad esempio, i cambiamenti conformazionali indotti dal legame del ligando sono spesso di fondamentale importanza per modulare la funzione enzimatica, sia organizzando i residui attivi del sito necessari per la catalisi, definendo siti di legame del substrato in meccanismi cinetici sequenziali, proteggendo gli intermedi reattivi dall'ambiente, sia modulando la funzione enzimatica attraverso reti allosteriche. Recenti studi hanno anche dimostrato che la dinamica conformazionale può essere conservata durante l'evoluzione e che le perturbazioni ai moti molecolari conservati possono essere correlate con i cambiamenti nella specificità del substrato e l'emergere di nuove funzionienzimatici 2,3.
Negli ultimi anni, la spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) è rapidamente emersa come una potente tecnica per sondare come i paesaggi conformazionali proteici rispondono a perturbazioni come il legame del ligando o la mutagenesi4,5,6,7. In un tipico esperimento HDX-MS (Figura 1), una proteina di interesse viene messa in tampone preparata in D2O, che innesca la sostituzione di protoni scambiabili con solventi con deuteria. Il tasso di scambio della moietà ammide dei legami peptidici dipende fortemente dal pH, dalla sequenza amminoacidica locale e dall'ambiente strutturale locale dell'ammide8. Le ammidi impegnate nelle interazioni di legame idrogeno (come quelle presenti in α-eliche e β fogli) si scambiano più lentamente delle ammidi nelle regioni non strutturate della proteina che sono esposte al solvente sfuso. Pertanto, l'estensione dell'assorbimento del deuterio è un riflesso della struttura dell'enzima. Ci si aspetta che enzimi conformi alla dinamica, o che subiscono transizioni strutturali al legame del ligando, producano una risposta HDX misurabile.
La base meccanicistica per il lento tasso di cambio di un'ammide strutturata è illustrata nella figura 25,8,9. Per sottoporsi all'HDX, la regione strutturata deve prima campionare transitoriamente una conformazione dispiegata, in modo che le molecole di solvente che catalizzano lo scambio di HDX attraverso uno specifico meccanismo acido/base chimica abbiano accesso all'ammide scambiabile. In definitiva, le grandezze relative del tasso di cambio chimico (kchem) e i tassi di piegatura e ripiegamento (kaperto e kvicino) determinano il tasso di HDX misuratonell'esperimento 5,8. Da questo semplice modello cinetico, è chiaro che l'estensione dell'assorbimento del deuterio rifletterà la dinamica conformazionale sottostante (come definita da kopen e kclose). La maggior parte degli esperimenti HDX-MS viene eseguita in un flusso di lavoro dal basso verso l'alto in cui, a seguito della reazione di scambio, la proteina di interesse viene digerita in peptidi e l'assorbimento del deuterio da parte di ciascun peptide viene misurato come un aumento dellamassa 7. In questo modo, HDX-MS consente di mappare le perturbazioni alla dinamica enzimatica conformazionale sulla scala spaziale locale dei peptidi, consentendo al ricercatore di valutare come la perturbazione alteri la dinamica in diverse regioni dell'enzima di interesse.
I vantaggi dell'approccio HDX-MS per chiarire la dinamica strutturale delle proteine sono numerosi. In primo luogo, il metodo può essere eseguito con piccole quantità di proteine native o su complessi proteici in sistemi con struttura quaternaria10. Non è nemmeno necessario che il preparato enzimatico utilizzato nel saggio sia altamente purificato11,12, purché il flusso di lavoro HDX-MS dal basso verso l'alto fornisca un numero sufficiente di peptidi identificati con sicurezza che coprono la sequenza proteica di interesse. Inoltre, HDX-MS può fornire informazioni sulla dinamica conformazionale in condizioni quasi native senza la necessità di etichettatura proteica site-specific come sarebbe utilizzata negli studi di fluorescenza a singolamolecola 13e non esiste un limite di dimensione al complesso proteico o proteico che può essere studiato (il che rende impegnativi approcci come la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare [NMR])7,14. Infine, i metodi HDX-MS risolti nel tempo possono essere utilizzati per studiare proteine intrinsecamente disordinate, che sono difficili da studiare con la cristallografia a raggi X15,16,17,18. La limitazione principale di HDX-MS è che i dati sono a bassa risoluzione strutturale. I dati HDX-MS sono utili per indicare dove la dinamica conformazionale sta cambiando e per rivelare cambiamenti conformazionali accoppiati, ma spesso non forniscono molte informazioni sul preciso meccanismo molecolare che guida il cambiamento osservato. Recenti progressi nella combinazione di metodi di dissociazione da cattura elettronica con dati proteina HDX-MS hanno mostrato promesse per la mappatura dei siti di scambio a singoli residui di amminoacidi19, ma gli studi biochimici e strutturali di follow-up sono ancora spesso necessari per fornire chiarezza ai modelli strutturali inoltrato dai dati HDX-MS.
Di seguito viene presentato un protocollo dettagliato per lo sviluppo di un test HDX-MS20. I protocolli di preparazione del campione presentati di seguito dovrebbero essere generalmente applicabili a qualsiasi proteina che mostri una buona solubilità in tamponi acquosi. Metodi di preparazione dei campioni più specializzati e flussi di lavoro HDX-MS sono disponibili per le proteine di quanto sia necessario saggiare in presenza di detergente o fosfolipidi21,22,23,24. Le impostazioni strumentali per la raccolta dei dati HDX-MS sono descritte per uno spettrometro di massa quadrupolo ad alta risoluzione accoppiato al sistema di cromatografia liquida. Dati di complessità e risoluzione simili potrebbero essere raccolti su uno qualsiasi dei numerosi sistemi di cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) disponibili in commercio. Vengono inoltre forniti aspetti chiave del trattamento dei dati utilizzando un pacchetto software disponibile in commercio. Presentiamo anche linee guida per la raccolta e l'analisi dei dati coerenti con le raccomandazioni formulate dalla più ampia comunità HDX-MS12. Il protocollo descritto viene utilizzato per studiare le proprietà strutturali dinamiche di HalM2, una sintetasi lanthipeptide che catalizza la maturazione multistep di un prodotto naturale peptide antimicrobico20. Illustriamo come HDX-MS può essere utilizzato per rivelare siti di legame del substrato e proprietà allosteriche che sono sfuggite alla caratterizzazione precedente. Diversi altri protocolli sulle proteine HDX-MS sono stati pubblicati negli ultimi anni25,26. Insieme al presente lavoro, questi contributi precedenti dovrebbero fornire al lettore una certa flessibilità nella progettazione sperimentale.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)</td><td>BioBasic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL Dispositivo di filtrazione centrifuga Amicon Ultracel 10k (Millipore)</td><td>Milipore Sigma</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647-25MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>SIGMA</td><td>a2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>ALDRICH</td><td>435767-100G</td><td></td></tr><tr><td>acido formico</td><td>Thermo Fisher</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>guanidina-HCl</td><td>VWR</td><td>97063-764</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>SiGMA-Aldrich</td><td>63068-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di</td> <td>potassioBioBasic</td><td>PB0440</td><td></td></tr><tr><td>fosfato di potassio</td><td>BioBasic</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>TCEP cloridrato</td><td>TRC Canada</td><td>T012500</td><td>peptide è stato sintetizzato su richiesta</td></tr><tr><td>Nome del materiale/ Attrezzatura</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deuteros</td><td>Andy M C Lau, et al</td><td>versione 1.08</td><td></td></tr><tr><td>DynamX</td><td>Waters</td><td>versione 3.0</td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Waters</td><td>versione 4.1</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lynx Global Server (PLGS)</td><td>Waters</td><td>versione 3.0.3</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml; dinger</td><td>versione 2.2.2</td><td></td></tr><tr><td>Nome del materiale/ Attrezzatura</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>Strumento e attrezzature</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C18 analitico Colonna</td><td>Acque 186002346</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-colonna</td><td>Acque</td><td>186003978</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class HDX System</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDX Manager</td><td>Waters microtip</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elettrodo pH</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-620-291</td><td></td></tr><tr><td>Waters Enzymate BEH colonna o Pepsina solumn</td><td>Waters</td><td>186007233</td><td></td></tr><tr><td>Waters Synapt Acque G2-Si</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

una piattaforma di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (hdx-ms) per lo studio degli enzimi biosintetici peptidici

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

La spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) è un metodo potente per la caratterizzazione biofisica dei cambiamenti conformazionali enzimatici e delle interazioni enzima-substrato. Tra i suoi numerosi benefici, HDX-MS consuma solo piccole quantità di materiale, può essere eseguito in condizioni quasi native senza la necessità di etichettatura enzima/substrato, e può fornire informazioni risolte spazialmente sulla dinamica enzimatica conformazionale, anche per grandi enzimi e complessi multiproteina. Il metodo è iniziato dalla diluizione dell'enzima di interesse in tampone preparato in D2O. Ciò innesca lo scambio di prozio in ammidi di legame peptidico (N-H) con deuterio (N-D). Nei punti di tempo di scambio desiderati, le aliquote di reazione vengono spente, l'enzima viene proteoliizzato in peptidi, i peptidi sono separati dalla cromatografia liquida ad alte prestazioni (UPLC), e il cambiamento di massa di ogni peptide (a causa dello scambio di idrogeno con deuterio) è registrato da MS. La quantità di assorbimento del deuterio da parte di ogni peptide dipende fortemente dall'ambiente locale di legame idrogeno di quel peptide. I peptidi presenti in regioni molto dinamiche del deuterio di scambio enzimatico molto rapidamente, mentre i peptidi derivati da regioni ben ordinate subiscono uno scambio molto più lento. In questo modo, il tasso HDX riporta la dinamica conformazionale enzimatica locale. Le perturbazioni ai livelli di assorbimento del deuterio in presenza di diversi ligandi possono quindi essere utilizzate per mappare i siti di legame dei ligandi, identificare le reti allosteriche e comprendere il ruolo della dinamica conformazionale nella funzione enzimatica. Qui, illustriamo come abbiamo usato HDX-MS per comprendere meglio la biosintesi di un tipo di prodotti naturali peptidici chiamati lanthipeptides. I lanthipeptidi sono peptidi geneticamente codificati che vengono modificati post-traslazionemente da grandi enzimi multifunzionali, conformazionali dinamici che sono difficili da studiare con i tradizionali approcci di biologia strutturale. HDX-MS fornisce una piattaforma ideale e adattabile per studiare le proprietà meccaniche di questi tipi di enzimi.

È necessario valutare la qualità della digestione proteolitica e la riproducibilità del flusso di lavoro per ogni serie di iniezioni di campioni. Pertanto, prima di eseguire test HDX-MS, è essenziale stabilire condizioni efficaci per la proteolisi della proteina di interesse, per la separazione dei peptidi utilizzando la cromatografia liquida in fase inversa e la mobilità ionica in fase gassosa e per il rilevamento di peptidi che utilizzano la SM. A tal fine, i campioni di riferimento per la proteina di interesse (raccol...

Le sintetasi lanthipeptide catalizzano reazioni multistep durante la biosintesi dei prodotti naturali peptidici. Qui descriviamo un flusso di lavoro continuo, dal basso verso l'alto, di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) che può essere utilizzato per studiare la dinamica conformazionale delle sintetasi lantaipeptide, così come altri enzimi simili coinvolti nella biosintesi del prodotto naturale peptidico.

Una piattaforma di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) per lo studio degli enzimi biosintetici peptidici

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Questo protocollo può fornire informazioni appositamente risolte sulla dinamica conformazionale delle proteine. Il che può aiutare a identificare le regioni funzionalmente importanti nelle proteine di interesse. Questa tecnica sonda la dinamica conformazionale delle proteine in condizioni quasi native.Senza la necessità di marcare le proteine utilizzando una quantità nanomolare di materiale per ogni reazione. Iniziare preparando campioni di riferimento non deuterati per la proteina di interesse in triplicato, in provette da 500 microlitri. Estinguere i campioni con il volume appropriato di tampone di quench per provetta per ottenere una lettura del pHmetro di 2,5.Congelare i campioni in azoto liquido per conservarli a meno 80 gradi Celsius fino alla loro analisi. Quindi analizzare i campioni di riferimento enzimatici proziati utilizzando un flusso di lavoro di spettrometria di massa con cromatografia liquida bottom-up secondo protocolli standard. Analizzare i dati grezzi della spettrometria di massa nell'apposito programma software di proteomica.Passa a Librerie e Banche dati di sequenze proteiche per importare la sequenza di amminoacidi della proteina di interesse. Immettere un nome per la sequenza proteica di interesse e importare la sequenza proteica in formato FASTA. Per definire i parametri di elaborazione nel menu Libreria, selezionare Electrospray MSE come tipo di acquisizione dati.Nel campo Blocca massa per carica 2, immettere 785,8426 per il rapporto di carica principale per i due più uno ione di glucano una fibra senza peptide B e fare clic su Fine. Per definire i parametri del flusso di lavoro, selezionare Electrospray MSE per il tipo di ricerca. Nell'intestazione Flusso di lavoro e query di ricerca nel database, selezionare la proteina del database creata nel campo Banca dati e modificare il reagente digest primario in non specifico.Per cancellare il campo del reagente modificatore fisso, tenere premuto il pulsante di controllo mentre si fa clic su Carbamidomethyl C.To specificare la directory di output, selezionare Opzioni, Impostazione automazione e Identifica E.Quindi selezionare le caselle di output 3D 3D e peptide 3D e di output per la contabilizzazione ionica. E specificare la directory desiderata. Per elaborare i dati del campione di riferimento, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla piastra per microtitolazione per creare una nuova piastra.Fare clic con il pulsante sinistro del mouse in un pozzetto e trascinare su altri tre pozzetti per evidenziare un pozzetto per ogni campione di riferimento. Quindi, fai clic con il pulsante destro del mouse e seleziona Aggiungi dati grezzi. Nella finestra, vai alla directory contenente i tre file di riferimento e seleziona tutti e tre i file contemporaneamente.Fare clic su Avanti e selezionare i parametri di elaborazione definiti. Fare nuovamente clic su Avanti e selezionare i parametri del flusso di lavoro definiti. Quindi fare clic su Fine.Una volta che i dati grezzi, i parametri di elaborazione e i parametri del flusso di lavoro sono stati assegnati a ciascun pozzetto sulla piastra, i pozzetti diventeranno blu. Selezionare i pozzetti, fare clic con il pulsante destro del mouse e selezionare Elabora dati grezzi più recenti. Per tenere traccia dell'elaborazione dei dati, fare clic sull'angolo inferiore destro della finestra.Quando non viene visualizzato alcun processo da eseguire, l'elaborazione è completa e i pozzetti nella piastra di microtitolazione diventano verdi. Fare clic con il pulsante destro del mouse sui pozzetti e selezionare Visualizza risultati flusso di lavoro. Si aprirà una finestra separata per ogni file di dati di riferimento.Ispezionare i dati per assicurarsi che la maggior parte dei segnali di spettrometria di massa nei dati del campione di riferimento siano stati mappati con successo sui peptidi previsti dalla digestione in silico della proteina di interesse. I peptidi corrispondenti appariranno in blu nello spettro di output. Fare doppio clic sul filtro ok e verificare che la percentuale di copertura sia superiore al 99%Importare l'output del software Proteomic nel software di elaborazione dello scambio di idrogeno e deuterio per un'ulteriore soglia.E fai clic su Dati e importa i risultati PLGS. Fare clic sull'icona Aggiungi e accedere alla directory appropriata per selezionare i file di dati elaborati. Fare clic su Avanti e impostare il numero minimo di ioni consecutivi su un valore maggiore o uguale a due.L'errore di massa a cinque parti per milione. E la soglia del file a tre, quindi fare clic su Fine. Per condurre reazioni di scambio idrogeno-deuterio, aliquotare il tampone di quench in provette da 500 microlitri.Centrifugare brevemente per trasferire tutto il tampone di tempra sul fondo di ciascuna provetta. Posizionare i tubi contenenti la soluzione temprata sul ghiaccio. Quindi, premiscelare tutti i componenti della reazione deuterata in una provetta separata da 1,5 millilitri.Quindi trasferire la miscela di reazione in un bagnomaria a temperatura controllata di 25 gradi Celsius per un'incubazione di 10 minuti. Aggiungere l'enzima ai componenti della reazione deuterata per avviare la reazione di scambio. Miscelare accuratamente il contenuto della reazione pipettando su e giù.Ai punti di tempo di scambio sperimentali appropriati, rimuovere aliquote di 50 microlitri da ciascuna reazione di scambio idrogeno-deuterio. E mescola le reazioni in modo rapido e uniforme con un'aliquota di tampone di quench ghiacciato in singole provette da 500 microlitri. Quindi tappare immediatamente le provette per il congelamento rapido in azoto liquido.Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'analisi. Dopo aver scongelato i campioni congelati, analizzare i campioni di riferimento enzimatici deuterati utilizzando lo stesso flusso di lavoro di spettrometria di massa per cromatografia liquida bottom-up sviluppato per i campioni di riferimento non deuterati. Dopo aver raccolto i dati LCMS per i campioni deuterati, importare i dati nel progetto di scambio di idrogeno e deuterio precedentemente creato per l'elaborazione dei dati.Fare clic su Nuovo stato e Nuova esposizione per definire gli stati biochimici e i tempi di esposizione al deuterio pertinenti all'analisi. Fare clic su Nuovo grezzo per selezionare i file di dati di scambio idrogeno-deuterio da analizzare. E assegna i tempi di scambio appropriati e lo stato biochimico a ciascun file di dati grezzi importato.Per l'analisi e la visualizzazione dei dati, selezionare il primo peptide nell'elenco Peptide e aprire il grafico spettrale impilato dal menu Visualizzazioni. Fare clic con il mouse per assegnare e annullare l'assegnazione degli stick in base alle esigenze per garantire che la corretta distribuzione isotopica sia stata individuata nei dati. E che ogni picco isotopico è stato assegnato.Per controllare le assegnazioni degli stick per ogni stato di carica, attivare o disattivare lo stato di carica nella parte superiore della finestra del grafico spettrale in pila. Per verificare la deviazione standard dei valori di assorbimento del peptide deuterio nel menu Visualizzazioni, selezionare la mappa di copertura. Che visualizza ogni peptide nell'elenco dei peptidi mappato lungo la sequenza di amminoacidi della proteina di interesse.Colora i peptidi in base alla deviazione standard relativa e cerca visivamente sulla mappa i peptidi anomali con l'alta deviazione standard relativa. Fare clic sui peptidi anomali nella mappa di copertura per popolare i grafici spettrali impilati e la finestra del visualizzatore dati con il peptide target. Visualizza la differenza di interesse nella mappa di copertura e fai clic con il pulsante destro del mouse sulla mappa per esportare i dati della differenza in un file CSV.Importa la differenza, i dati di stato e il file PDB della proteina di interesse in Deuteros. E seleziona l'intervallo di confidenza del 99% e Abilita somma ed elabora i dati. Quindi, in pi mol, selezionare Esporta, Assorbimento ed Esportazione per generare uno script PyMOL per mappare le regioni di differenza di scambio significativa sulla struttura PDB della proteina di interesse nel software PyMOL.Questi cromatogrammi ionici totali rappresentativi per tre campioni di riferimento della peptide sintetasi lambda Hal-M2 mostrano le variazioni dipendenti dal tempo nella somma di tutti i conteggi ionici a tutti i valori del rapporto massa-carica inclusi nella scansione spettrale di massa. La forma e l'intensità del profilo del cromatogramma ionico totale dovrebbero essere simili. Indicando che la digestione proteolitica di Hal-M2 è riproducibile.Ed è di efficienza simile in tutti e tre i campioni di riferimento. Anche gli spettri di massa in un dato intervallo di tempo dovrebbero essere simili. Fornendo la certezza che peptidi simili siano presenti all'interno di ciascun campione e alludono in momenti simili dalla colonna C18.La maggior parte dei peptidi nei campioni scambiati con deuterio dovrebbe mostrare evidenti cambiamenti nelle distribuzioni isotopiche verso valori più elevati del rapporto massa-carica. Ad esempio, questi dati indicano che una frazione sostanziale dell'etichetta del deuterio veniva mantenuta durante il corso della raccolta dei dati di quench, digestione della pepsina e spettrometria di massa con cromatografia liquida. Dopo la caratterizzazione delle proprietà biochimiche dell'enzima, come dimostrato, è possibile generare risultati rappresentativi della spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio come questi.Illustrare il legame del peptide precursore Hal-A2 all'AMP Hal-M2, complesso PMP. Le reazioni di scambio idrogeno-deuterio devono essere preparate e spente in modo coerente. E devi essere metodico nel determinare i valori di scambio del deuterio per numerosi peptidi rilevati.La spettrometria di massa a scambio di idrogeno e deuterio fornisce informazioni a livello di peptidi e cambiamenti conformazionali dinamici delle proteine. La rilevanza funzionale di qualsiasi scambio idrogeno-deuterio dovrebbe essere convalidata per Meter Genesis. E saggi di attività ortogonale.

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MALDI-TOF spettrometria di massa è stato utilizzato con successo per monitorare la amide idrogeno / deuterio in cambio di attivazione della proteina chinasi Pak2.

Ammide Idrogeno / Deuterio Scambio &amp; massa MALDI-TOF analisi di spettrometria di attivazione Pak2

Proteine ​​conformazione e la dinamica sono la chiave per comprendere il rapporto tra struttura e funzione delle proteine. Scambio idrogeno accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione è un metodo versatile per studiare le dinamiche conformazionali di proteine ​​e caratterizzazione della proteina-ligando e proteina-proteina interazioni, comprese le interfacce di contatto ed effetti allosterici.

Analizzando la dinamica delle proteine ​​che utilizzano l&#39;idrogeno Scambio Spettrometria di Massa

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Mass spettrometrica Approcci alla struttura studio e interazioni proteina in liofilizzati Polveri

flessibilità conformazionale gioca un ruolo critico nella funzione delle proteine. Qui, si descrive l'utilizzo di spettrometria di massa elettrospray ionizzazione tempo risolto accoppiato a scambio idrogeno-deuterio per sondare i rapidi cambiamenti strutturali che guidano funzione di proteine ​​ordinate e disordinate.

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

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Definizione attività di Chaperone Redox-regolati di Hsp33 e mappatura cambiamenti conformazionali su Hsp33 usando la spettrometria totale di scambio di idrogeno-deuterio

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Scambio idrogeno/deuterio basato sull'elettroforesi capillare per la caratterizzazione conformazionale di proteine con spettrometria di massa top-down

L'insieme strutturale dell'alfa-sinucleina monomerica influenza la sua funzione fisiologica e le proprietà fisico-chimiche. Il presente protocollo descrive come eseguire la spettrometria di massa a scambio idrogeno/deuterio al millisecondo e le successive analisi dei dati per determinare le informazioni conformazionali sul monomero di questa proteina intrinsecamente disordinata in condizioni fisiologiche.

Spettrometria di massa a scambio idrogeno/deuterio al millisecondo per lo studio della dinamica strutturale dell'alfa-sinucleina in condizioni fisiologiche

Presentiamo qui protocolli per purificazione per affinità di complessi proteici e la loro separazione dal blu PAGE nativa, seguiti da proteine ​​correlazione profilatura mediante un'etichetta disponibile spettrometria di massa quantitativa. Questo metodo è utile per risolvere interattomi in distinti complessi proteici.

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gocce lipidiche sono organelli importanti per la replicazione di diversi agenti patogeni, tra cui il virus dell'epatite C (HCV). Si descrive un metodo per isolare le goccioline lipidiche per la spettrometria di massa quantitativa delle proteine ​​associate; può essere utilizzato in una varietà di condizioni, come l'infezione da virus, stress ambientale, o di trattamento farmacologico.

Isolamento Droplet per l&#39;analisi quantitativa dei lipidi Spettrometria di Massa

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Scopri la spettrometria di massa HDX-MS per analizzare la dinamica conformazionale delle lantipeptide sintetasi. Questo metodo bottom-up identifica regioni funzionalmente importanti senza necessità di marcatura.

Una piattaforma di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) per lo studio degli enzimi biosintetici peptidici (Video) | JoVE Journal

Una piattaforma di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) per lo studio degli enzimi biosintetici peptidici

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