Immunostaining dei test di Drosophila a montaggio intero per l'analisi confocale 3D di grandi spermatociti

La colorazione a montaggio intero dei tessuti di Drosophila, come i campioni di testicoli, è spesso problematica a causa della limitata penetrazione degli anticorpi. Il nostro protocollo di fissazione con NP40 ed eptano consente una marcatura uniforme e riproducibile. Mantenendo la forma del tessuto e consentendo la penetrazione profonda degli anticorpi, questa procedura facilita l'acquisizione riproducibile e quantificabile dell'immunocolorazione in tre dimensioni, sia singolarmente che in studi di colocalizzazione.

Per la valutazione delle cellule germinali diploidi, da zero a 15 ore dopo l'eclosione, anestetizzare le mosche con una breve esposizione all'anidride carbonica e trasferire le mosche su un cuscinetto per mosche. Posizionare il tampone sotto un microscopio da dissezione con un ingrandimento 10X e utilizzare una pinza per rimuovere le teste da cinque a 10 mosche maschi. Trasferisci i corpi di mosca decapitati in 100 microlitri di tampone di Ringer su un vetrino rivestito di silicone su un supporto di sfondo nero, e usa l'ingrandimento 40X e un paio di pinze numero cinque per afferrare una mosca tra il torace e l'addome.

Quindi allontanare l'addome dal torace e isolare rapidamente i testicoli e i tessuti adiacenti dalla carcassa della mosca. Una volta raccolti tutti i testicoli, pulire i campioni da eventuali residui di tessuto e utilizzare un puntale per pipette da 200 microlitri per rimuovere il tampone in eccesso intorno ai testicoli sezionati. Quindi posizionare una goccia di paraformaldeide al 4% sui testicoli e trasferire rapidamente i tessuti in un tubo contenente due millilitri di soluzione di paraformaldeide al 4% appena preparata integrata con il 20% di NP40 ed eptano.

Per un fissaggio completo dei campioni dei testicoli, agitare la provetta verticalmente per 30 secondi prima di incubare i testicoli su un miscelatore rotante a temperatura ambiente per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, trasferire la provetta in un rack per provette e lasciare che i testicoli si depositino sul fondo della provetta. Rimuovere tutto l'eptano e la soluzione fissativa e sciacquare rapidamente i testicoli tre volte con PBS.

Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire i testicoli in una nuova provetta da 200 microlitri e utilizzare una pipetta da 200 microlitri dotata di un puntale da 10 microlitri per rimuovere il tampone in eccesso. Quindi aggiungere 200 microlitri di PBS-To fresco al tubo e posizionare i testicoli sul ghiaccio. Per la marcatura degli anticorpi dei campioni dei testicoli, sostituire il PBS con 200 microlitri di PBS-T allo 0,3% per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente.

Dopo la permeabilizzazione, bloccare qualsiasi legame non specifico con 0,3% di PBS-T più il 5% di siero di capra normale per un'ora a temperatura ambiente prima di aggiungere 200 microlitri dell'anticorpo primario di interesse diluito in 0,3% di PBS-T più il 5% di siero di capra normale per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius o a temperatura ambiente con oscillazione. La mattina successiva, lavare i campioni con tre lavaggi di 15 minuti con PBS-T fresco allo 0,3% e farli oscillare a temperatura ambiente per lavaggio e lasciare che i testicoli si depositino sul fondo della provetta per gravità. Aggiungere 200 microlitri di un anticorpo secondario appropriato alla provetta per un'incubazione di quattro ore con oscillazione a temperatura ambiente al riparo dalla luce prima di lavare i campioni in PBS-T fresco allo 0,3% per lavaggio, come dimostrato.

Dopo il lavaggio con PBS-T allo 0,3%, lavare i campioni una volta in PBS-T allo 0,2% e una volta in PBS-T allo 0,1% per 30 minuti per lavaggio sul bilanciere, seguito da un lavaggio finale di 30 minuti in solo PBS. Dopo il lavaggio con PBS, etichettare i campioni con 180 microlitri di una soluzione DAPI da un microgrammo per millilitro in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce, seguiti da tre lavaggi di 5 minuti in PBS fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare un cerchio su un vetrino pulito e utilizzare una punta per pipetta innescata con PBS-T allo 0,1% per trasferire i testicoli sul vetrino.

Aspirare l'eventuale eccesso di PBS e aggiungere 100 microlitri di Citifluor AF1. Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetto sul fazzoletto, facendo attenzione a non intrappolare bolle d'aria, e utilizzare uno smalto trasparente per sigillare il vetrino coprioggetti sul vetrino prima di osservare i vetrini con la microscopia a fluorescenza confocale. Dopo aver acquisito le immagini confocali dei campioni, importare le immagini in un programma software di analisi delle immagini appropriato.

Quindi utilizzare la segmentazione manuale per definire il nucleo all'interno di ciascuna cellula e determinare i coefficienti di correlazione di Pearson all'interno dell'intero volume tra due fluorofori. Questo protocollo consente l'acquisizione di immagini confocali di qualità sufficiente per essere trattate per la ricostituzione 3D. Ad esempio, in queste quattro sezioni seriali adiacenti di uno spermatocita in stadio S5, si osserva un basso livello di Mad1 nell'involucro nucleare e un accumulo di alto livello di Mad1 può essere visualizzato in combinazione con la colorazione DAPI all'interno del nucleo.

in questa immagine ricostituita in 3D, la presenza di basso livello di Mad1 sulla superficie nucleare e l'accumulo di alto livello di Mad1 all'interno del nucleo possono essere osservati insieme al DNA. In queste ricostituzioni 3D, si possono osservare grandi spermatociti S5 colorati con nucleoporina 62 e Mad1 o importina-beta e DAPI. In entrambe le ricostruzioni, i componenti associati ai pori nucleari sembrano essere distribuiti in modo non uniforme sul bordo nucleare come punti di dimensioni irregolari.

Oltre a conservare il volume 3D delle cellule, questo protocollo facilita anche una penetrazione uniforme degli anticorpi di interesse nella profondità di ogni cellula, consentendo analisi quantitative, come la colocalizzazione. Poiché il protocollo consente una misurazione affidabile delle colocalizzazioni da testicoli indipendenti, può essere utilizzato anche per confrontare la colorazione in diversi genotipi di mosca. La quantità di NP40 utilizzata è fondamentale per una permeabilizzazione sufficiente.

Se la procedura viene seguita attentamente, è possibile ottenere un'etichettatura riproducibile e la conservazione della struttura nucleare 3D. Sebbene la colorazione dell'intero montaggio dei tessuti all'interno della Drosophila possa essere complicata, questo protocollo può essere facilmente adattato ad altri campioni.