Name: Isolatie van endocardiale en coronaire endotheelcellen van de Ventriculaire Vrije Muur van het Hart van de Rat (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Leer endocardiale en coronaire endotheelcellen isoleren uit rattenharten met hoge zuiverheid en viabiliteit. Deze methode ondersteunt onderzoek naar celtype-specifieke mechanismen bij hartziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs zeer waarderen Dr Lingli Wang voor haar hulp met het dier protocol, en het ministerie van Kindergeneeskunde op Stanford voor ondersteuning van de infrastructuur. Dit werk werd ondersteund door NIH/NHLBI K99 HL135258 (naar M.G.).

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het Administratief Panel on Laboratory Animal Care (APLAC31608) van Stanford University.
1. Voorbereiding van buffers
<ol><li>Bereid de vergistingsbuffer voor met behulp van de reagentia in tabel 1.<ol>
<li>Bereid de DNase I voorraadoplossing voor: Los DNase I op in RNase-vrij water voor een voorraadoplossing van 2.000 eenheden/mL (1 mg/mL). Aliquot en bewaar de voorraadoplossing op -20 °C.</li>
		<li>Bereid de liberase oplossing voor: Los liberase op met RNase-vrij water voor een voorraadoplossing van 5 mg/mL. Draai het op een rolbank bij 4 °C gedurende 30 min. Aliquot en bewaar de voorraadoplossing op -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid de sorteerbuffer voor door 0,5 M ethylenediaminetetraazijnzuur (EDTA) en 10% runderserumalbumine (BSA) voorraadoplossing met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) te verdunnen voor een eindconcentratie van 2 mM EDTA en 0,5% van BSA.</li>
</ol>2. Hartcollectie
OPMERKING: Zes Sprague Dawley ratten met een gewicht van 50-100 g werden gebruikt in dit protocol. Er werd geen genderverschil waargenomen.
<ol><li>Euthanaseer de rat met CO2 en plaats hem in een supine positie op een ontleedplatform. Pin de ledematen naar beneden en steriliseren zowel de buik en borst met 70% ethanol.</li>
	<li>Open de buik met een schaar en steek een 21 G naald in het gedeelte van de achterste vena cava gelegen achter de darmen. Trek de spuitzuiger terug, haal het bloed uit de ader totdat de lever lichter van kleur lijkt en er geen bloed meer kan worden ingetrokken, wat wijst op voldoende bloedverwijdering.</li>
	<li>Met behulp van een schaar, open de borst zorgvuldig om te voorkomen dat beschadiging van de long en het hart. Til de aorta boog / atrium met de tangen en snijd de aorta, longslagader, longaders, en vena cava te bevrijden en het hart te verwijderen.</li>
	<li>Was het hart met 50 mL koude 1x Hanks' balanced salt solution (HBSS) buffer 3x om overmatig bloed te verwijderen.</li>
	<li>Verwijder onder een microdissectiemicroscoop de rechter ventriculaire vrije wand in een 5 mL-buis met dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) (Figuur 1A,B).<ol>
<li>Leg het hart op zijn vlakkere, achterste gezicht om de linker- en rechterkant te identificeren.</li>
		<li>Zoek de longslagader, de meest voorste van de aderen en slagaders vertakking van de bovenkant van het hart en snijd door de longslagader naar de rechter ventriculaire kamer. Op het voorste gezicht van het hart, snijd langs het septum tot het bereiken van de top. Doorgaan met het snijden van de top van de achterste kant van het hart langs het septum tot de longslagader en de rechter ventriculaire kamer knooppunt punt (Figuur 1A).</li>
		<li>Vanaf de longslagader en rechter ventriculaire knooppunt, snijd zowel de voorste en achterste kant van het hart loodrecht op de vorige dissectie en uit de buurt van het septum, totdat de rechter ventriculaire vrije muur is bevrijd van de rest van het hart (Figuur 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder onder de microdissectiemicroscoop de linker ventriculaire vrije wand in een 5 mL-buis met DMEM (Figuur 1C,D).<ol>
<li>Zoek de aorta, vertakking van de bovenkant van het hart achter de longslagader, en herhaal de methode beschreven in stap 2.5 af te snijden van de linker ventriculaire vrije muur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EEG-spijsvertering
<ol><li>Plaats zowel rechts als links ventriculaire vrije wandweefsels in een 60 cm cultuurschaal met het binnenoppervlak plat liggen, naar beneden gericht (Figuur 2). OPMERKING: Het binnenoppervlak is het binnenvlak van de licht holle vorm van ventrikel zoals afgebeeld in figuur 2A,C.</li>
	<li>Voeg 0,5–1 mL van de spijsvertering buffer aan de schotel, het plaatsen van de punt van de pipet direct onder het weefsel. Ga door tot alleen het binnenoppervlak is ondergedompeld.</li>
	<li>Incubeer de schotel in een 5% CO2,37 °C incubator gedurende 5 min.</li>
	<li>Voeg EG medium aan de cultuur schotel om de spijsvertering te stoppen. OPMERKING: Houd de hoeveelheid vergistingsbuffer tot EG-medium als 1:5-verhouding.</li>
	<li>Gebruik een pipet van 1 mL om het binnenoppervlak van de ventrikels met EG-medium te spoelen en breng de afvloeiing over in een 50 mL-opvangbuis door middel van een zeef van 40 mm (figuur 2E). Houd de collecties op ijs voor downstream zuivering.</li>
</ol>4. CEC-spijsvertering
<ol><li>Snijd langs het buitenoppervlak van de linker ventrikel zonder verontreiniging van de binnenste laag (Figuur 2B,D) en plaats elk in een aparte 5 mL buis met 1 mL van de spijsvertering buffer. OPMERKING: De linker ventrikel kan worden geïdentificeerd als de dikkere ventrikel, en het buitenoppervlak kan worden bepaald als de buitenkant van de licht holle ventrikel.</li>
	<li>Met behulp van dissectie schaar, gehakt de ventriculaire wand in kleine, 1 mm3 stukken.</li>
	<li>Incubeer de buis in een 37 °C waterbad gedurende ongeveer 15-20 min. Vortex elke 2-3 min.</li>
	<li>Pipetteer 4 mL EG-medium in de 5 mL buis om de spijsvertering te beëindigen.</li>
	<li>Breng de oplossing met een 5 mL serologische pipet in een buis van 50 mL door middel van een 40 mm zeef (Figuur 2E). Houd de collecties op ijs voor downstream zuivering.</li>
</ol>5. Celverzameling
<ol><li>Centrifugeer de buizen op 300 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur (RT) en zuig vervolgens de supernatant aan.</li>
	<li>Als de pellet rood lijkt, de pellet opnieuw opschorten in 1-2 mL van 1x rode bloedcellen (RBC) lysing buffer (Figuur 2F). OPMERKING: Als er geen RBCs zijn, gaat u verder met stap 6.</li>
	<li>Incubeer de buizen in een waterbad van 37 °C gedurende 5 min.</li>
	<li>Pipetteer 10 mL PBS in de 50 mL buizen om de lysis te stoppen.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen op 300 x g gedurende 10 min bij RT en zuig vervolgens de supernatant aan.</li>
</ol>6. EG-sortering
<ol><li>Voeg 90 μL sorteerbuffer en 10 μL anti-CD31 PE-antilichaam toe aan de 50 mL-buizen.</li>
	<li>Draai de buizen en broed ze vervolgens 10 min uit in een koelkast van 4 °C.</li>
	<li>Voeg 10 mL sorteerbuffer toe aan de buizen, meng grondig en centrifugeer vervolgens op 300 x g voor 10 min bij RT.</li>
	<li>Zuig de supernatant aan en stouw de pellet opnieuw in 80 μL sorteerbuffer en 20 μL anti-PE microbeads.</li>
	<li>Draai de buizen en broed bij 4 °C gedurende 15 min.</li>
	<li>Was de cellen door 10 mL sorteerbuffer in de buizen toe te voegen, meng grondig en centrifugeer ze vervolgens op 300 x g voor 10 min bij RT.</li>
	<li>Zuig de supernatant aan en stouw de pellet opnieuw in 500 μL sorteerbuffer.</li>
	<li>Plaats een kolom met superparamagnetische bollen in een magnetische afscheider en spoel de kolom af met 3 mL sorteerbuffer.</li>
	<li>Nadat de kolom "stroomstop" is, pipettt500 μL van de celsuspensie in de kolommen en was de kolommen vervolgens met sorteerbuffer. Herhaal de was 3x, elk met 3 mL sorteerbuffer(figuur 2G).</li>
	<li>Verwijder de kolommen uit de separator en plaats ze op een nieuwe 15 mL-inzamelbuis.</li>
	<li>Voeg met een pipet 5 mL EG-medium toe aan de kolommen en stuw de oplossing door een kolomzuiger te gebruiken.</li>
	<li>Centrifugeer de opvangbuizen op 300 x g gedurende 10 min bij RT en zuig vervolgens de supernatant aan.</li>
	<li>Haal het RNA uit de celpellets van de EEG- en CEC-monsters met behulp van een kit, volgens de instructies van de fabrikant. Een minimum van 500 ng RNA kan worden verkregen. OPMERKING: Na RNA-extractie kan het monster worden opgeslagen bij -80 °C.</li>
	<li>Reverse transcriberen 500 ng van RNA om cDNA te krijgen met behulp van een willekeurige primer en een kit, volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Voer kwantitatieve PCR uit voor de validatie van endocardiale en endotheelpopulaties (figuur 2H). Primersequenties worden vermeld in tabel 2.<ol>
<li>Voeg 5 μL EEC of CEC cDNA (1 ng/μL) toe aan de putten van een 384 qPCR plaat. Voeg de EEG of CEC cDNA in voldoende putten, zodat er drie putten per aantal primers.</li>
		<li>Meng 6 μL van 2x qPCR SYBR groene buffer met 0,5 μL van elke 10 μM primer, inclusief zowel vooruit als achteruit primers, en voeg ze toe in een enkele put die overeenkomt met elk kandidaat-gen.</li>
		<li>Sluit de plaat af met plastic folie en centrifugeer 1 min bij 300 x g bij RT.</li>
		<li>Plaats de plaat in een qPCR-machine en start het programma op 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 95 °C voor 15 s, en vervolgens 55 °C voor 60 s. Herhaal de volgende twee stappen gedurende 45 cycli.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gladka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Sequencing+of+the+Healthy+and+Diseased+Heart+Reveals+Cytoskeleton-Associated+Protein+4+as+a+New+Modulator+of+Fibroblasts+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Sequencing of the Healthy and Diseased Heart Reveals Cytoskeleton-Associated Protein 4 as a New Modulator of Fibroblasts Activation.</a> Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).</li>
<li>Koren, C. W., Sveinbjornsson, B., Smedsrod, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+endocardial+endothelial+cells+from+Atlantic+salmon+%28Salmo+salar%29+and+Atlantic+cod+%28Gadus+morhua%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of endocardial endothelial cells from Atlantic salmon (Salmo salar) and Atlantic cod (Gadus morhua).</a> Cell and Tissue Research. 290 (1), 89-99 (1997).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subepicardial+endothelial+cells+invade+the+embryonic+ventricle+wall+to+form+coronary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Subepicardial endothelial cells invade the embryonic ventricle wall to form coronary arteries.</a> Cell Research. 23 (9), 1075-1090 (2013).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151 (5), 1083-1096 (2012).</li>
<li>Li, Y., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessing+endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases.</a> Nature Reviews in Cardiology. 15 (8), 445-456 (2018).</li>
<li>Zhang, H., Lui, K. O., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+Cell+Plasticity+in+Cardiac+Development%2C+Diseases+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Endocardial Cell Plasticity in Cardiac Development, Diseases and Regeneration.</a> Circulation Research. 122 (5), 774-789 (2018).</li>
<li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+coronary+artery-derived+endothelial+cells+in+vivo+from+patients+undergoing+percutaneous+coronary+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human coronary artery-derived endothelial cells in vivo from patients undergoing percutaneous coronary interventions.</a> Journal of Vascular Research. 46 (5), 487-494 (2009).</li>
<li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464 (7288), 549-553 (2010).</li>
<li>Kamimura, T., Yamagishi, T., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+coronary+endothelium+is+a+mosaic+of+sinus+venosus-+and+ventricle-derived+endothelial+cells+in+a+region-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Avian coronary endothelium is a mosaic of sinus venosus- and ventricle-derived endothelial cells in a region-specific manner.</a> Development, Growth and Differentiation. 60 (2), 97-111 (2018).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardium+Minimally+Contributes+to+Coronary+Endothelium+in+the+Embryonic+Ventricular+Free+Walls%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Endocardium Minimally Contributes to Coronary Endothelium in the Embryonic Ventricular Free Walls.</a> Circulation Research. 118 (12), 1880-1893 (2016).</li>
<li>Kinlay, S., Libby, P., Ganz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function+and+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Endothelial function and coronary artery disease.</a> Current Opinion in Lipidology. 12 (4), 383-389 (2001).</li>
<li>Jacques, D., Bkaily, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+endothelial+cell+hypertrophy+takes+place+during+the+development+of+hereditary+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Endocardial endothelial cell hypertrophy takes place during the development of hereditary cardiomyopathy.</a> Molecular and Cell Biochemistry. 453 (1-2), 157-161 (2019).</li>
<li>Grossfeld, P., Nie, S., Lin, L., Wang, L., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome%3A+A+New+Paradigm+for+an+Old+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Hypoplastic Left Heart Syndrome: A New Paradigm for an Old Disease.</a> Journal of Cardiovascular Development and Disease. 6 (1), (2019).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulated+RGS5+by+genetic+variants+impairs+endothelial+cell+function+and+contributes+to+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Down-regulated RGS5 by genetic variants impairs endothelial cell function and contributes to coronary artery disease.</a> Cardiovascular Research. , (2019).</li>
<li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Endocardial+Defect+in+Hypoplastic+Left+Heart+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq Reveals Endocardial Defect in Hypoplastic Left Heart Syndrome.</a> bioRxiv. , (2019).</li>
<li>Chen, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sinus+venosus+contributes+to+coronary+vasculature+through+VEGFC-stimulated+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The sinus venosus contributes to coronary vasculature through VEGFC-stimulated angiogenesis.</a> Development. 141 (23), 4500-4512 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

LOF's en EER's verschillen in oorsprong, markers en functies, en kunnen dus een unieke rol spelen in ontwikkeling en ziekte. De bestaande protocollen voor endotheliale celisolatie zijn beperkt tot macrovasculaire weefsels, waardoor de verzameling eer's worden verwaarloosd, waardoor de studie van CEC- en EEG-specifieke functies wordt beperkt. Het is van essentieel belang deze twee populaties onafhankelijk te isoleren en te bestuderen, aangezien deze kennis een referentie zou zijn voor de differentiatie van iPSC's in LMOE's en EER's voor toekomstige studies en het onderzoek van deze celpopulaties op mogelijke therapeutische doelen voor verschillende hartziekten zou vergemakkelijken. Dit nieuwe protocol schetst een methode voor de isolatie van EER's van het binnenoppervlak en LC's van de buitenzijde van de ventriculaire vrije wand van volwassen ratten.
Het is van cruciaal belang om de timing voor elke stap zeer nauwkeurig in dit protocol te controleren. Omdat het aantal EECs zeer beperkt is in rattenhartweefsel, hebben we de spijsverteringstijd van de binnenste laag van het hart geminimaliseerd om cellulaire schade te voorkomen en nog belangrijker, CEC-besmetting. Onmiddellijke toevoeging van de EG-medium oplossing om de enzymatische reactie te beëindigen is ook zeer belangrijk voor het behoud van een hoge levensvatbaarheid van de cel. Een rode pellet na celverzameling suggereert de aanwezigheid van een groot aantal RBC's. Afhankelijk van de hoeveelheid RBC-verontreiniging kan 1-2 mL rbc-lysisbuffer worden toegevoegd om de RBC's te degraderen. Incubatie moet zorgvuldig worden getimed om aanzienlijke schade aan de cellen te voorkomen, en PBS wordt onmiddellijk toegevoegd om de reactie te beëindigen. Met behulp van het huidige protocol konden we 105 EER's isoleren van zes rattenharten. Deze cellen kunnen worden gezaaid op een cel kweek schotel voor verdere uitbreiding en karakterisering.
Bij de voorbereiding van het weefsel voor vrije wandverzameling, werd het hart gewassen met HBSS om de meerderheid van de resterende RBCs te verwijderen. HBSS is het aanbevolen medium vanwege zijn heldere verschijning, waardoor de visualisatie van bloedcellen mogelijk is, in tegenstelling tot DMED met fenolrood. De samenstelling van de spijsverteringsbuffer zorgt voor voldoende bevrijding van endotheelcellen, waar liberase digestie enzym strips het weefsel van de blootgestelde cellen, DNase I elimineert DNA uit de dode cellen ter bevordering van celloslating die kunnen worden geremd door lijm kwaliteit DNA,waar liberase spijsvertering saldi de pH, en DMEM is een gewijzigd basaal medium met een hogere concentratie van aminozuren en vitaminen voor een betere cel onderhoud en bevat het calcium dat nodig is om de liberase te activeren.
Volgens de eencellige RNA sequencing (scRNA-seq) verkregen uit zowel menselijke15 en muis hart10, verschillende markers toegeschreven aan specifieke EG-populaties werden gemeld. We selecteerden enkele van de meest verrijkte genen om de zuiverheid van geïsoleerde EECs (d.w.z. Npr3, Cdh11en Hapln1) en EECs (d.w.z. Mgll, Fabp4en Cd36)te onderzoeken. Ten opzichte van β-Actin, Npr3, Cdh11en Hapln1 vertoonden de markers een verhoogde expressie in EER's in vergelijking met LMOE's. Ook de expressie van Mgll, Fabp4en Cd36 markers was groter in LMOE's in vergelijking met EER's. De uniek uitgedrukte markeringen voor elk monster zijn in overeenstemming met de markers die kenmerkend zijn voor respectievelijk EER's en LMOE,wat duidt op een succesvolle isolatie.
Het huidige protocol kan echter niet uitsluiten dat kruisbesmetting tussen de twee EG-populaties tijdens de isolatie, zelfs met zorgvuldig gecontroleerde sequentiële vertering. Daarom kunnen sommige celoppervlaktemarkeringen worden aangebracht voor verdere zuivering. Zo labelt NPR3 over het algemeen het endocardium10, terwijl APJ een meerderheid van de LMOE's16kan traceren . Omdat deze twee markers worden uitgedrukt op het celoppervlak, kunnen ze worden gebruikt voor fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS), en antilichamen die worden gebruikt om verschillende EG-populaties verder te zuiveren. Bovendien kunnen menselijke15- en muis10-hartscRNA-seq de verrijking van10 Npr3 in EER's bevestigen en kan Cd36 mogelijk worden gebruikt voor CEC-zuivering.
Tot slot schetst het gepresenteerde protocol de onafhankelijke isolatie van EER's en LMOE's uit het rattenhart. De uitgebreide identificatie van cellulaire eigenschappen, ingeschakeld door celisolatie, kan worden gebruikt voor belangrijke downstream-toepassingen.

Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol (gewijzigd van Gladka et al.1) voor de dissectie en daaropvolgende isolatie van endocardiale endotheelcellen (EECs) en coronaire endotheelcellen (CECs) uit rattenharten. De mogelijkheid om deze celpopulaties onafhankelijk te onderzoeken zou het mogelijk maken om celtypespecifieke mechanismen te verkennen die ten grondslag liggen aan een verscheidenheid aan hartziekten die als potentiële therapeutische doelen kunnen dienen. Een succesvolle methode voor het onafhankelijk verzamelen van deze celpopulaties moet echter nog worden gepubliceerd.
De LOF's verschillen van EER's wat betreft hun oorsprong, markers en functies tijdens hartontwikkeling en ziekte1,,2,3,4,5,6,7. EE's komen voort uit het ventrale oppervlak van het hartmesoderm3. Ze ontstaan uit Flk1+ voorlopercellen in reactie op VEGF en HIF signalering en vormen de binnenste laag van de drie afzonderlijke gebieden van het ontwikkelende hart: het atrium, de ventrikel en de sinusvenosus3,6. Genetische afstammingstracering suggereert dat de pluripotente endocardiale cellen van de sinus venosus veneuze cellen afleiden, die migreren naar de subepicardiale laag3. Vervolgens onderscheidt de subepicardiale laag zich in kransslagaders en aders, waaronder CEC's, die over de perifere ventriculaire vrije wand3,4blijven. Deze endocardiale endotheel route wordt gereguleerd door VEGFC, ELA / APJ, en SOX17 signalering3,4,6,8,9. Het ventriculaire endocardium ontleent de minder CEC's van het interventriculaire septum door een onbekend mechanisme3. Vervolgens wordt gelokaliseerde differentiatie tussen EER's en LOF's voorgesteld door markeringen die specifiek zijn voor deze twee celpopulaties, waaronder Mgll, Fabp4 en Cd36-expressie in LMOE' s, of Npr3, Cdh11 en Hapln1-expressie in EER3,5,10.
EER's en LMOE's spelen verschillende rollen in de hartfunctie. Endocardial aan mesenchymale overgang, klepvorming, kamerrijping, uitstroomkanaalverordening, en atrioventriculaire kanaalontwikkeling zijn afhankelijk van EECs6. Als alternatief, CEC's bijdragen aan vasomotorische toon en ontsteking van kransslagaders11. Deze verschillen in functie resulteren in geïndividualiseerde rollen in ziekteontwikkeling4,12. Er zijn bijvoorbeeld aanwijzingen dat slecht functionerende EES's kunnen leiden tot aangeboren klepziekte6, noncompaction myocardium6, atrioventriculair septaal effect6, endocardiale fibroelastose13, hypoplastisch linkerhartsyndroom13, ventriculaire hypoplasie13, en cardiale hypertrofie12. Op dezelfde manier hebben studies aangetoond dat abnormale CEC's bijdragen aan coronaire hartziekte14 en trombose11.
Succesvolle isolatie van EER's en LMOE's is noodzakelijk om uitgebreide kennis van deze twee celpopulaties te bereiken, die zowel in de onderzoeks- als in de klinische omgeving kunnen worden gebruikt. Het bepalen van de groei- en differentiatiefactoren van deze celpopulaties zou een referentie zijn voor de differentiatie van endotheelsubtypes van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). Verder is volledige identificatie van de verschillen in de ontwikkeling, regulering en functie van EER's en LMOE's van vitaal belang voor het begrijpen van de genomische en epigenomische factoren die verantwoordelijk zijn voor talrijke hartziekten op een celtype-specifieke manier. Dit artikel schetst stappen voor de succesvolle verzameling van EER's en LMOE's onafhankelijk, en biedt bewijs van scheiding door de genexpressie niveaus van celtype-specifieke markers te beoordelen.

<table><tbody><tr><td>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>1M</td></tr><tr><td>15ml Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030122151</td><td></td></tr><tr><td>50ml Tubes</td><td>Nunc</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>5ml Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30119401</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31 PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-115-505</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PE microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>10%</td></tr><tr><td>CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-rad</td><td>1855485</td><td>Voor qPCR</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington</td><td>LK 003172</td><td>1 mg/mL in water</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10313021</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EC Medium</td></tr><tr><td>Ethylendiaminetetraacetic Acid (EDTA)</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>0.5 M</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) X1</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Hard-Shell 384-Well PCR Plates, thin wall, skirted, clear/white</td><td>Bio-rad</td><td>HSP3805</td><td>Voor qPCR</td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401119001</td><td>5 mg/mL</td></tr><tr><td>MACS LS Column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Voor EC isolatie</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>Voor EC isolatie</td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical</td><td>Bio-rad</td><td>MSB1001</td><td>Voor qPCR</td></tr><tr><td>Narrow Pattern Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11002-12</td><td>Voor hartoogst</td></tr><tr><td>Nylon Sterile Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td>40 mm</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) X1</td><td>Gibco</td><td>1001023</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25780</td><td>Voor qPCR</td></tr><tr><td>Quick-RNA Microprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1050</td><td>Voor RNA extractie</td></tr><tr><td>S&amp;T Forceps - SuperGrip Tips</td><td>F.S.T</td><td>00632-11</td><td>Voor hartoogst</td></tr><tr><td>Strabismus Scissors - Tungsten Carbide</td><td>F.S.T</td><td>14574-11</td><td>Voor hartoogst</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - Microserrated</td><td>F.S.T</td><td>15007-08</td><td>Voor hartoogst</td></tr></tbody></table>

isolatie van endocardiale en coronaire endotheelcellen van de ventriculaire vrije muur van het hart van de rat

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Het is aangetoond dat endocardiale endotheelcellen (EECs) en coronaire endotheelcellen (CECs) verschillen in oorsprong, ontwikkeling, markers en functies. Bijgevolg spelen deze twee celpopulaties een unieke rol bij hartziekten. De huidige studies met geïsoleerde endotheelcellen onderzoeken celpopulaties die bestaan uit zowel EER's als LMOE's. Dit protocol schetst een methode om deze twee celpopulaties onafhankelijk te isoleren voor celspecifieke karakterisering. Na het verzamelen van de linker en rechter ventriculaire vrije wand, endotheelcellen van het buitenoppervlak en het binnenoppervlak worden afzonderlijk bevrijd met behulp van een spijsvertering buffer oplossing. De sequentiële vertering van het buitenoppervlak en de binnenste endocardiale laag behielden de scheiding van de twee endotheelcelpopulaties. De afzonderlijke isolatie van EER's en LMOE's wordt verder gecontroleerd door de identificatie van voor elke populatie specifieke merkers. Op basis van eerder gepubliceerde single cell RNA profilering in het muishart, de Npr3, Hapln1, en Cdh11 gen expressie is uniek voor EECs; terwijl Fabp4, Mgllen Cd36 genexpressie uniek is voor CEC's. qPCR-gegevens toonden verrijkte expressie van deze kenmerkende merkers in hun respectieve monsters aan, wat wijst op een succesvolle ISOLATIE van de EEG en de CEC, alsmede het behoud van het celfenotype, waardoor verdere celspecifieke functionele analyse mogelijk is.

Het proces van isolatie van de EEG en de CEC wordt beschreven in figuur 2. De succesvolle isolatie van EER's en LMOE's werd bepaald door de aanwezigheid van pan-endotheelcelmarkers te beoordelen, evenals die welke verschillen hebben voor de twee subtypepopulaties. Zoals voorspeld, qPCR bleek βdat ten opzichte vanβ-actine, EECs uitgedrukt hogere niveaus van endocardialmarkers Npr3, Hapln1, en Cdh11 in vergelijking met CECs (figuur 3A). Evenzo drukten DEC's hogere niveaus van coronaire markers Fabp4, Mgllen Cd36 uit in vergelijking met EER's (figuur 3B). Bovendien drukten zowel EEC's als LMOE het pan-EC-markergen Cdh5uit , met iets hogere niveaus in CEC (figuur 3C).
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig1v5.jpg"> Figuur 1: Diagram van hartdissectie. (A) Eerste snede gemaakt om de rechter ventrikel vrije muur te scheiden van het septum. (B) Tweede snede gemaakt om de rechter ventrikel volledig te bevrijden. (C) Eerste snede gemaakt om de linker ventrikel vrije muur te scheiden van het septum. (D) Tweede snede gemaakt om de linker ventrikel volledig te bevrijden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig1v4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig2v5.jpg"> Figuur 2: Diagram van de opzet van de spijsvertering van de LMOE's en EER's en de volgende regeling voor celsortering. (A) Binnenstevrije ventriculaire wand en (B) buitenste ventriculaire vrije wand werden (C) ondergedompeld in de spijsvertering buffer of (D) verteerd in de spijsvertering buffer respectievelijk. (E) Inzameling en filtratie van celoplossingen gevolgd door (F) rode bloedcellen (RBC) lysis en (G) magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) met behulp van het CD31-antilichaam. h) Gezuiverde EC's werden verwerkt voor genexpressieverificatie met behulp van qPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig2v4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
 <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61126/61126fig3v5.jpg"> Figuur 3: qPCR-gegevens die de isolatie van LOF's en EER's verifiëren. aA) De genexpressieniveaus van de EEG-markeringen Npr3, Cdh11en Hapln1 in EER's en LOF's werden gekwantificeerd door real-time PCR. bB) De genexpressieniveaus van de CEC-markers Mgll, Fabp4en Cd36 in EER's en LOF's werden gekwantificeerd door real-time PCR. (C) De pan-EC marker Cdh5 werd gekwantificeerd in EER's en LOF door real-time PCR. (n = 3 in elke groep). De balken vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,01 vs. EEG, ongepaarde t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61126/61126fig3v4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Tabel 1. Spijsverteringsbuffer (1,5 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td> </td>
			<td>Stock Con.</td>
			<td>Laatste con.</td>
			<td>Volume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Liberase TM</td>
			<td>5 mg/ml</td>
			<td>0,5 mg/ml</td>
			<td>150 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dnase I</td>
			<td>1 mg/ml</td>
			<td>20 ug/ml</td>
			<td>30 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES HEPES</td>
			<td>1 M</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>15 ul</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM (DMEM)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1305 ul</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Recept voor de spijsverteringsbuffer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">Tabel 2. Primersequenties</td>
		</tr>
<tr>
<td>Naam van het gen</td>
			<td>Doorsturen</td>
			<td>Omgekeerde</td>
		</tr>
<tr>
<td>Npr3 (Npr3)</td>
			<td>TCCTTGCAAATCATGGCCTA</td>
			<td>GGAATCTTCCCGCAGCTCTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh11</td>
			<td>GTGAATGGGACTGGGACTGG</td>
			<td>GTAATTTCTGGGGCCCTTGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hapln1 (Hapln1)</td>
			<td>CCAGCTAAGTGGGACTCGAAG</td>
			<td>GGGCCATTTTTCAGCTTGGATG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mgll Mgll</td>
			<td>CCCGGGGCCCAAAGAC</td>
			<td>GAAGATGAGGGCCTTGGGTG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fabp4 Fabp4</td>
			<td>AGAAGTGGGAGTTGGCTTCG</td>
			<td>ACTCTCTGACCGGATGAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cd36</td>
			<td>GCAAAACGACTGCAGGTCAA</td>
			<td>CCCGGTCACTTGGTTTTCTGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cdh5</td>
			<td>CCATTGAGACAGACCCCGAC</td>
			<td>TGTGGAGTGTGCTGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>B-actin</td>
			<td>TCTGTGTGGATTGGTGGCTC</td>
			<td>CGGACTCATCGTACTCCTGC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Primersequenties

We presenteren een protocol voor de isolatie van endocardiale en coronaire endotheelcellen uit rattenharten door sequentiële weefselvertering in een spijsverteringsbuffer, celverzameling uit terugkerende centrifugecycli en celzuivering met behulp van antiratten-CD31 microbeads.

Isolatie van endocardiale en coronaire endotheelcellen van de Ventriculaire Vrije Muur van het Hart van de Rat

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het isoleren van endocardiale cel- en coronaire endotheelcellen afzonderlijk van het hart om mensen te helpen de celtypespecifieke genexpressie en -functie te begrijpen. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn een hoge zuiverheid en levensvatbaarheid van de geïsoleerde EEG- en LIC's en dat de cellen hun fysiologische eigenschappen behouden bij isolatie. CEC's en EDC's verschillen in vele aspecten, dus de mogelijkheid om deze celpopulaties onafhankelijk te onderzoeken, maakt het mogelijk om celtypespecifieke mechanismen in verschillende hartziekten te onderzoeken.Deze methode zou de studie van transcriptonomische en epigenetische factoren die verantwoordelijk zijn voor tal van hartziekten op een cel type-specifieke manier te vergemakkelijken. De lastigste delen van deze methode zijn het bepalen van de verschillende hartgedeelten en het correct timen van de spijsvertering om besmetting van het celtype te voorkomen. Het aantonen van de procedure zal Yifei Miao zijn, een onderzoeker van mijn lab.Na het oogsten van harten van zes 50 tot 100 gram Sprague Dawley ratten, was de organen met 50 milliliter koude HBSS drie keer om overtollig bloed te verwijderen en plaats een hart onder een ontleden microscoop. Plaats het hart op zijn vlakkere achterste gezicht om de linker- en rechterkant van het weefsel te identificeren en de longslagader te lokaliseren. Gebruik een schaar om door de longslagader naar de rechter ventriculaire kamer te snijden en langs het septum te snijden totdat de top is bereikt.Blijf snijden vanaf de top tot aan de achterste kant van het hart langs het septum tot de kruising van de longslagader en de rechter ventriculaire kamer is bereikt. Vanaf dit punt, snijd zowel de voorste en achterste zijden van het hart loodrecht op de vorige dissectie punt en uit de buurt van het septum tot de rechter ventriculaire vrije muur is bevrijd van de rest van het hart. Plaats vervolgens de rechter ventriculaire vrije muur in een vijf milliliter buis van DMEM en zoek de aorta opnieuw om het verzamelen van de linker ventriculaire vrije muur te vergemakkelijken op dezelfde manier als zojuist aangetoond.Wanneer alle ventriculaire vrije wanden zijn verzameld, breng de weefselmonsters in een 60 centimeter cultuur schotel met hun innerlijke oppervlakken liggend gezicht naar beneden in de schotel. Met behulp van een een milliliter pipet tip, voeg 0,5 tot een milliliter van de spijsvertering buffer aan de schotel direct onder de weefselstukken totdat alleen de binnenste oppervlakken van de weefsels worden ondergedompeld. Om ongewenste celverontreiniging te voorkomen, is het belangrijk dat alleen het binnenoppervlak van de ventrikel wordt ondergedompeld in de spijsverteringsbuffer en precies vijf minuten wordt verteerd.Na vijf minuten in de celcultuur incubator, stop de spijsvertering met vijf keer het volume van endotheelcel medium. Gebruik vervolgens een 1 milliliter pipet om het binnenoppervlak van elke ventrikel door te spoelen met vers medium dat de runoff door een 40 micrometer zeef in een 50 milliliter verzamelingsbuis op ijs overdraagt. Voor coronaire endotheelcelvertering, gesneden langs het buitenoppervlak van de linker ventrikel zonder verontreiniging van de binnenste laag en plaats elk buisfragment in een aparte vijf milliliter buis met een milliliter spijsverteringsbuffer.Om besmetting door EECs te voorkomen, is het belangrijk om alleen te snijden van het buitenoppervlak van de ventrikel. Met behulp van dissectie schaar, gehakt van de ventriculaire muur in kleine een kubieke millimeter stukken en plaats de buizen in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 15 tot 20 minuten met vortexing om de twee tot drie minuten. Wanneer de gehakte stukken zijn klein, maar zichtbaar, voeg vier milliliter van endotheelcel medium aan de buis en gebruik een vijf milliliter serologische pipet om het hele volume van de oplossing over te brengen door middel van een 40 micrometer zeef in een 50 milliliter collectie buis op ijs.Om de CD31 positieve celpopulaties na hun spijsvertering te isoleren, pellet de cellen door centrifugatie en het aanzuigen van de supernatants. Als er pellets rood zijn, resuspend de cellen in een tot twee milliliter rode bloedcel lyse buffer per buis voor een vijf minuten incubatie in een 37 graden Celsius waterbad. Aan het einde van de incubatie, stop de lysis met 10 milliliter PBS en verzamel de cellen met een tweede centrifugatie.Voeg vervolgens 90 microliter sorteerbuffer en 10 microliter anti-CD31 PE-antilichaam toe aan elke buis van cellen. Na het vortexen, incubeer de cellen gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Voeg aan het einde van de incubatie 10 milliliter sorteerbuffer toe aan de buizen met grondig mengen en verzamel de cellen door middel van centrifugatie.Resuspend de pellets in 80 microliter van het sorteren buffer per buis, gevolgd door de toevoeging van 20 microliters van anti-PE microbeads. Na het vortexen, plaats de buizen op vier graden Celsius gedurende 15 minuten, gevolgd door het wassen in 10 milliliter van sorteren buffer door centrifugatie zoals net aangetoond. Resuspend de pellets in 500 microliters van het sorteren buffer op ijs en plaats een kolom met super paramagnetische bollen in een magnetische separator.Spoel de kolom af met drie milliliter sorteerbuffer. Wanneer de kolom is geleegd, voeg 500 microliter van de endocardiale endokoepleiale cel suspensie aan de kolom, gevolgd door vier wasbeurten met drie milliliters sorteerbuffer per wasbeurt. Breng na de laatste wasbeurt de kolom over in een nieuwe 15 milliliter opvangbuis en gebruik de kolomzuiger en vijf milliliter vers endotheelcelmedium om de cd31-positieve cellen uit de kolom in de opvangbuis te spoelen.Verzamel vervolgens de bead geïsoleerde endotheelcellen door centrifugatie. Zoals voorspeld, kwantitatieve PCR blijkt dat ten opzichte van beta actin, endocardial endokoepleiale cellen uitgedrukt hogere niveaus van de endocardial markers Npr3, Hapln1, en Cdn11 in vergelijking met coronaire endotheelcellen. Ook coronaire endotheelcellen uitgedrukt hogere niveaus van de coronaire markers Fabp4, Mgll, en Cd36 in vergelijking met endocardial endotische endotheelcellen.Bovendien, beide soorten cellen uitgedrukt de pan-endotheelcel marker gen Cdh5 met iets hogere niveaus waargenomen in coronaire endotheelcellen. We kunnen de cellen verder zuiveren met FACS en antilichamen die specifiek zijn voor de celpopulaties. We kunnen bijvoorbeeld anti-Npr3 gebruiken om EECs en anti-Cd36 te sorteren om LMOE's te sorteren.Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers om de rol van EEG- en LMOE's in hartontwikkeling en -ziekte op een celtypespecifieke manier te onderzoeken.

isolation-endocardial-coronary-endothelial-cells-from-ventricular

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Volwassen hartspiercellen zijn primaire cellen die kunnen worden geïsoleerd uit dierlijke harten en gekweekt voor meerdere dagen. Binnen deze cultuur periode adenovirale gentransfer kan gebruikt worden om genetisch gecodeerd biosensoren (GEBS) of TL-fusie-eiwitten uit te drukken. Beide benaderingen laten cellulaire onderzoeken door middel van confocale microscopie.

Isolatie en genetische manipulatie van Adult hartspiercellen voor confocale Imaging

Wij bieden een methode voor het isoleren en kweken van zuivere populaties van hartklep endotheelcellen (VEC). VEC kan worden geïsoleerd uit beide zijden van de cusp of bijsluiter en onmiddellijk na de onderliggende interstitiële cel (VIC) isolatie is eenvoudig.

Isolatie van Valvulaire endotheelcellen

Deze methode voor het isoleren van functionele immuun cellen van het hart biedt een alternatief voor de conventionele methoden van collagenase spijsvertering, die ongewenste immuun-cel activatie veroorzaakt, wat resulteert in een verminderde respons van deze cellen. Onze methode van isolatie levert functionele hart immuuncellen door het vermijden van problemen die samenhangen met enzymatische spijsvertering.

Isolatie van Functionele Cardiac immuuncellen

Primaire celkweek is een nuttige techniek voor het analyseren van specifieke populaties van cellen, in het bijzonder van transgene muis embryo's op specifieke ontwikkelingsstadia. Hierin zijn embryonale ventrikels ontleed en gedissocieerd en antilichaam-geconjugeerde kralen herkennen en scheiden de endotheelcellen voor verdere analyse.

Isolatie van embryonale ventriculaire endotheelcellen

De mogelijkheid om endotheelcellen van hartkleppen (VEC's) te isoleren, is van cruciaal belang voor het begrijpen van mechanismen van klepontwikkeling, onderhoud en ziekte.  Hier beschrijven we de isolatie van VEC's van embryonale en volwassen Tie2-GFP muizen met behulp van FACS, wat studies mogelijk maakt om de bijdrage van VEC's in ontwikkelings- en ziekteprocessen te bepalen.

Isolatie van Murine Valve endotheelcellen

Het doel van dit protocol is de isolatie en kweektechnieken van murine primaire vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) van de coronaire circulatie demonstreren. Zodra VSMC's werden geïsoleerd, kunnen ze worden gebruikt voor vele standaard kweektechnieken.

Isolatie van muizen coronaire vasculaire gladde spiercellen

Dit protocol is opgesteld om onze methode voor het isoleren van muizen coronaire endotheelcellen te delen, met als doel beeldvorming of om moleculair-biologische experimenten uit te voeren.

Isolatie van muis coronaire endotheelcellen

Verscheidene protocollen zijn ontwikkeld en beschreven voor de isolatie van verschillende hartcel typen uit een rat hart. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven dat de isolatie van hoge kwaliteit grote hartcellen (cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten) van een enkel preparaat mogelijk maakt, waardoor de experimentele kosten worden verminderd.

Gelijktijdige isolatie van hoogwaardige cardiomyocyten, endothelcellen en fibroblasten uit een volwassen rat hart

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd, Langendorff gebaseerde procedure voor de isolatie van eencellige atriale cardiomyocytes van een rat model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie. Een handmatige regulering van de intraluminale druk van cardiale Holten is geïmplementeerd om de opbrengst van functioneel intact myocytes geschikt voor excitatie-contractie-koppeling studies.

Isolatie van atriale Cardiomyocytes van een Rat Model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie

Gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van menselijke en dierlijke ventriculaire cardiomyocyten van vibratome-cut myocardische plakjes. Hoge opbrengsten van calciumtolerante cellen (tot 200 cellen/mg) kunnen worden verkregen uit kleine hoeveelheden weefsel (&lt;50 mg). Het protocol is van toepassing op myocardium dat tot 36 uur aan koude ischemie wordt blootgesteld.

Isolatie van human ventriculaire cardiomyocyten van Vibratome-Cut Myocardial Slices

We presenteren een methode voor het isoleren van endotheelcellen en kernen uit het lumen van muiscarotisslagaders die zijn blootgesteld aan stabiele of verstoorde stroomomstandigheden om eencellige omics-experimenten uit te voeren.

Isolatie van endotheelcellen uit het lumen van muisslagaders voor eencellige multi-omics-experimenten

Leer endocardiale en coronaire endotheelcellen isoleren uit rattenharten met hoge zuiverheid en viabiliteit. Deze methode ondersteunt onderzoek naar celtype-specifieke mechanismen bij hartziekten.

Isolatie van endocardiale en coronaire endotheelcellen van de Ventriculaire Vrije Muur van het Hart van de Rat

Meer video's verkennen