Мы описываем метод генерации насыщенных библиотек транспосонных мутантов в грам-отрицательных бактериях и последующую подготовку библиотек ДНК-ампликона для секвенирования высокой пропускной способности. В качестве примера мы ориентируемся на патоген ESKAPE, Acinetobacter baumannii, но этот протокол подотменен широкому кругу грам-отрицательных организмов.