Vi beskriver en metod för att generera mättande transposon mutanta bibliotek i Gram-negativa bakterier och efterföljande beredning av DNA-amplikon bibliotek för hög genomströmning sekvensering. Som ett exempel fokuserar vi på ESKAPE-patogenen, Acinetobacter baumannii, men detta protokoll är mottagligt för ett brett spektrum av gramnegativa organismer.