Fare Derisi ve Ağız Boşluğundaki Gen İşlevlerini Aynı Anda Değerlendirmek için Vivo CRISPR/Cas9 Taraması

Bu protokol önemlidir, çünkü araştırmacıların baş ve boyun kanserindeki yüzlerce genin tümör baskılayıcı fonksiyonlarını aynı anda geleneksel bir nakavt fare modelinin maliyetinin çok altında araştırmasına izin verir. Bu teknik esnektir ve ciltteki işlevlerini incelemek için genlerin ekspresyonunu kapsayacak şekilde uyarlanabilir. Hedeflenen CRISPR kütüphane protokolü diğer kanser türleri için de uygulanabilir.

Anestezi uygulanmış hayvanın ventral tarafı yukarı bakacak şekilde ısıtılmış ameliyat aşamasına yerleştirin ve pençeleri yerinde tutmak için cerrahi bant kullanın. Ameliyat tamamlanana kadar sürekli bir izofluran ve oksijen kaynağı için nosecone anestezi tüpünü uygulayın. E9.5 gebeliğini doğrulamak için, karın bölgesine az miktarda tüy dökücü krem uygulayın ve pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak üç x üç santimetre karelik bir alana yayın.

İki ila üç dakika sonra, kremi gazlı bez veya mendille nazikçe çıkarın ve alanı PBS ve% 70 etanol kullanarak silerek temizleyin. Ultrason probunu ve jeli kullanarak, hamile fareyi embriyonik gün E9.5 için kontrol edin. Bu, ameliyat gününde zaman kazanmak için bir gün önce E8.5'te de yapılabilir.

Ultrason jelini çıkarın ve BPS ve ardından% 70 etanol kullanarak alanı silerek temizleyin. En çok deri altı analjezik ile enjekte edin. Daha sonra ciltte dikey bir kesi yapmak için steril forseps ve makas kullanın.

Kesi etrafındaki cildi peritondan ayırmak için künt forseps kullanın. Sonra karın zarını kesmek için steril forseps ve makas kullanın. Künt forseps kullanarak, sol ve sağ uterus boynuzunu nazikçe dışarı çekin ve embriyoları sayın.

Rahim boynuzlarının çoğunu yeniden yerleştirin, ancak üç embriyo içeren bir rahim boynuzunun distal ucunu açıkta bırakın. Künt forseps kullanarak, modifiye edilmiş Petri kabının silikon zarındaki açıklıktan uterusu üç embriyo ile hafifçe itin ve çekin. Modelleme kili küpleri kullanarak Petri kabını stabilize edin.

Silikon bir kalıp kullanarak uterusu Petri kabının içindeki üç embriyo ile stabilize edin. Daha sonra künt bir alet kullanarak embriyoların yan tarafındaki silikon tıkacı düzleştirin. Petri kabını steril PBS ile doldurun ve Petri kabının altındaki silikon zarı hamile barajın karnıyla yıkayın, böylece herhangi bir sızıntıyı önleyin.

Ultrason başlığını, üst embriyonun yaklaşık 0,5 santimetre yukarısındaki Petri kabına yerleştirin ve sahneyi, amniyotik boşluğun ultrason görüntüsünde net bir şekilde görülebilmesi için ayarlayın. Enjektör iğnesini dikkatlice modifiye edilmiş Petri kabına hizalayın. Mikromanipülatörü kullanarak, iğnenin ucunu üst embriyonun beş milimetre yakınına yerleştirin, ardından ucunun ultrason görüntüsünde en parlak göründüğü düzleme hareket etmek için iğneyi ileri geri hareket ettirin.

Mikromanipülatörü kullanarak, iğneyi rahim duvarından amniyotik boşluğa itin. 62 nanolitre lentivirüsü sgRNA kütüphanesi ile yavaş bir enjeksiyon hızında enjekte edin. Embriyo başına toplam 496 nanolitre için Enjekte düğmesine sekiz kez basın.

Diğer iki embriyo için de aynı işlemi tekrarlayın. Ardından ultrason kafasını kaldırın ve silikon tapayı çıkarın. Üç embriyonun ilk ikisini steril bir pamuklu çubuk kullanarak farenin karnına nazikçe itti.

Sonraki üç embriyoyu dışarı çekin ve daha önce enjekte edilen üçüncü embriyoyu içeri itin. İstenilen sayıda embriyo enjekte edilene kadar enjeksiyon prosedürünü tekrarlayın ve 30 dakikalık anesteziyi aşmamaya dikkat edin. Bittiğinde, ultrason kafasını kaldırın, mikromanipülatörü iğne ile çıkarın, PBS'yi aspire edin ve Petri kabını çıkarın.

Steril mendiller kullanarak, karın boşluğunda birikmiş olabilecek herhangi bir PBS'yi emdirin. Periton kesisini emilebilir dikişler kullanarak kapatın. Ardından karın derisindeki kesiyi kapatmak için iki zımba kullanın.

Daha sonra, plazmit ve lentiviral kütüphane transdüksiyonlu hücrelerden PCR amplifiye DNA'nın nesil dizileme okumaları yüksek bir korelasyon göstermelidir. Plazmit DNA'dan okunan sgRNA, sgRNA'ların eşit temsilini göstermiyorsa, viral hazırlama ve konsantrasyon prosedürü dikkatle tekrarlanmalıdır. Doğum sonrası P0'da E9.5 Lox-STOP-Lox konfeti fare yavrularında Cre rekombinaz taşıyan lentivirüsün ultrason eşliğinde enjeksiyonunun sonuçları burada gösterilmektedir.

Yüksek virüs titresi, farenin derisinin daha geniş bir şekilde kaplanmasına neden olurken, aynı zamanda birden fazla sgRNA'nın aynı hücreye transdüksiyonuna neden olur. Bu grafik, plazmit ve lentiviral kütüphane transdüksiyonlu hücrelerden PCR ile amplifiye edilmiş DNA'nın yeni nesil dizileme okumalarını ve ayrıca dört temsili tümörden okumaları göstermektedir. Tümör baskılayıcıları ADAM10 ve RIPK4'ü hedefleyen sgRNA kılavuzları, plazmit havuzuna veya enfekte hücrelere kıyasla tümör örneklerinde zenginleştirilir.

Ameliyatın E9.5'te yapılması çok önemlidir. Haçı kurduktan dokuz gün sonra ultrason ile hamileliği kontrol etmeyi ve her dişi farede embriyonik zaman noktasını belirlemeyi unutmayın. Yavrular doğduktan sonra, dönüştürülen hücreler, tek hücreli RNA dizilimi gibi en son gen profilleme teknikleri kullanılarak izole edilebilir ve kapsamlı bir şekilde profillenebilir.