使用双光束扫描电子显微镜从玻璃体生物样品制备薄片进行冷冻电子断层扫描

该协议概述了用于冷冻电子断层扫描的恶性疟原虫感染红细胞玻璃体薄片的制备。这样就可以直接观察有关寄生虫如何引起疟疾的详细结构信息。冷冻电子断层扫描记录有关细胞内部的高分辨率信息。

它足够强大，可以原位观察单个蛋白质复合物，可以通过计算提取和平均来揭示蛋白质的三维结构信息。该协议可以很容易地适应不同的细胞类型，并且可以作为刚开始生产玻璃体薄片用于冷冻电子断层扫描的人的起点。这是亚历杭德拉·卡巴哈尔，他今天将执行协议。

首先，使用光学显微镜的冷冻载物台筛选冷冻铜网格，特别注意网格上冰的梯度。检查单个网格方块在较薄的冰区中的细胞覆盖率。使用黑色不可磨灭的标记标记冷冻FIB-SEM专用自动网格轮辋的正面和另一侧。

将夹住的网格装入 Cryo-FIB-SEM 穿梭车中，碳面朝上，并在细胞表面涂上四纳米厚的碳或铂电子束旋转涂层。将穿梭车加载到冷冻FIB-SEM中，并通过SEM在5千伏下评估每个网格上的细胞分布。以 100 次方的低放大倍率概览查看整个网格的冰梯度。

然后以5， 000次方拍摄更高放大倍率的图像，以查看单个网格正方形。通过将气体注入系统针插入网格上方的腔室并将有机铂源加热到设定温度设定的时间内以产生蒸汽流，在每个网格的表面上涂上两微米的有机铂涂层。要观察样品，请倾斜样品，使网格的平面与离子束的入射角成大约10度，并移动合适的网格正方形的中心，以便在SEM和FIB图像中看到。

使用低电流下的离子束，以高放大倍率测量网格以可视化网格正方形中心的细胞。标记出两个要铣削的矩形图案，一个在三微米厚的保护区域上方，一个在下方。然后选择光束设置并通过调整亮度和对比度来校正散光。

设置完成后，以 300 皮安的电流开始铣削，同时在离子束视图中监控实时进度，并通过 SEM 间歇性地监控。在SEM视图中检查样品，并在第一次铣削后，如果离子束没有穿过受保护区域上方和下方的样品，则通过增加矩形图案的高度来去除更多材料。当薄片上方和下方的表面在离子束视图中完全光滑时停止铣削。

逐步重复研磨过程，每次减少离子束电流，直到达到300纳米的厚度。记录每个薄片的 X Y Z 位置。要在实验结束时抛光薄片，请使用低倍率SEM概览选择要抛光的一组薄片并标记抛光根部。

标记抛光根部后，将两个矩形图案之间的空间减小到 100 到 200 纳米，并以 30 皮安的离子束电流开始抛光。通过 SEM 在两到三千伏电压下监控进度。当薄片中的对比度被SEM丢失或有机铂涂层或薄片本身开始失去完整性时，停止抛光。

获取并保存每个薄片的低放大倍率 SEM 图像。实验完成后，从显微镜上取下梭子。取出带有薄片的网格并将其储存在液氮下。

小心处理网格。为了研究形态学，使用E-64抑制剂中的化合物2将裂殖子停滞在出口的不同阶段。在化合物二存在下，寄生虫膜与宿主红细胞中周围血红蛋白之间的边界是明确的。

完整的寄生液泡或PVs在单个血红素晶体簇中填充了裂殖子。当化合物两个同步裂殖子被洗涤到E-64中时，PV膜破裂，裂殖子在红细胞内扩散。铜网格上良好细胞分布的典型例子显示具有明确外围和完整液泡膜的大红细胞。

在部分塌陷的宿主红细胞内，单个裂殖子被可视化为小细胞簇。每个裂殖子的中心都有一个黑点，指示血红素晶体的位置。铣削后，将网格加载到TEM中，以确定薄片的位置，并通过断层扫描找到合适的目标区域。

在样品显微照片中，可以看到最近被裂殖子侵入的红细胞。在红细胞边界内可以看到被宿主细胞衍生膜包围的裂殖子。在裂殖子的顶端，围绕细胞的两层膜和堆叠在与电子致密蘑菇形特征相关的裂殖子顶端的四层膜清晰可见。

在裂殖子的细胞质内，鉴定出裂殖子质膜和多层囊泡之间的融合事件。在对 230 纳米厚的薄片进行的额外 TEM 分析中，观察到用 E-64 处理的成熟裂殖子的典型形态。在红细胞膜内，可以看到裂殖子质膜与细胞器一起出现，如内膜复合物、极环、微克涅糖、罗氏体和核包膜。

该技术最重要的部分是优化网格，以实现可重复和高效的薄片生产。该技术的进一步发展将使研究人员能够可视化疟疾寄生虫中的单蛋白分子，并确定它们在疟疾出口中的作用。