Name: Rilevamento e analisi automatizzati dellesocitosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Scopri un software automatizzato per rilevare eventi esocitotici in sequenze di immagini TIRF con fluorofori pH-sensibili. Classifica quattro modalità di fusione e analizza la distribuzione spaziale con Ripley's K.

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Ringraziamo Dustin Revell e Reginald Edwards per aver testato il codice e la GUI. Il finanziamento è stato fornito dal National Institutes of Health ha sostenuto questa ricerca: tra cui R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) e F31NS103586 (FLU).

1. Scegli set di dati e directory
<ol><li>Per selezionare i set di dati da eseguire per l'analisi, fare clic sul pulsante Trova set di dati (Figura 2A, casella rossa 1) per passare alla cartella in cui sono depositati i dati (ad esempio, cartella RawData). I file di dati popoleranno automaticamente i file di dati come elenco. Nella cartella possono essere presenti più set di dati.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Scegli directory e selezionare la directory (ad esempio, Test) in cui verranno depositati i file analizzati (Figura 2A, casella rossa 2) . Un insieme di cartelle e file di analisi finiti, nonché immagini temporanee intermedie, verranno creati in questa directory quando si preme il pulsante Analisi. Gli errori verranno prodotti se non viene scelta una directory.</li>
</ol>2. Imposta la dimensione dei pixel e il framerate
<ol><li>Inserisci la frequenza fotogrammi e la dimensione dei pixel appropriate delle immagini nell'apposita casella "Framerate" o "pixel size"(Figura 2A,casella verde). Se non vengono forniti valori (sono impostati su "0" predefinito), il programma cercherà i metadati associati al file per il framerate e la dimensione dei pixel. Se questi valori non vengono trovati, il programma verrà impostato per impostazione predefinita su per-pixel per la misurazione e per fotogramma per i punti temporali. NOTA: nell'esempio fornito, il framerate è 100 e la dimensione dei pixel è 0,08.</li>
</ol>3. Scegli o crea maschere
<ol><li>Utilizzare il pulsante Mask Maker per creare automaticamente maschere di cella per i dati nell'elenco dei set di dati di file (Figura 2A, casella blu). Dopo aver utilizzato il pulsante Mask Maker, verrà creata una nuova cartella nella directory scelta chiamata MaskFiles. L'"Indicatore di esecuzione" diventerà giallo durante l'esecuzione e tornerà in verde al termine. NOTA: una maschera per ogni file nell'elenco File di dati verrà creata dai primi 10 fotogrammi del file di immagine (o da tutti i fotogrammi se sono presenti meno di 10 nel file di immagine) e depositata nella cartella MaskFiles utilizzando lo schema di denominazione appropriato (descritto di seguito).</li>
	<li>Assicurarsi che i file maschera popolano automaticamente l'elenco File maschera. L'utente può procedere direttamente all'analisi. NOTA: controllare sempre visivamente i file maschera e confermare che acquisiscano l'intera regione di interesse. Il primo fotogramma del file di dati e il file maschera vengono visualizzati nell'interfaccia utente quando selezionata. (Figura 2B). Mask Maker può produrre errori in caso di basso rapporto segnale-rumore, quindi la convalida che i file maschera siano appropriati è fondamentale per il controllo di qualità.</li>
	<li>In alternativa all'utilizzo di Mask Maker, se il segnale al rumore delle immagini è insufficiente, creare manualmente le maschere in ImageJ.<ol>
<li>Innanzitutto, aprire il file di immagine raw in ImageJ (Figura 3A).</li>
		<li>Fare clic sul pulsante Selezione poligono e fare clic per disegnare una maschera attorno alla cella. Una volta terminato, fare doppio clic sull'ultimo punto per completare il poligono.</li>
		<li>Una volta terminato, vai a Modifica | | di selezione Crea maschera (Figura 3B). Verrà creata una nuova maschera invertita in base al disegno poligonale. Salvare le maschere in una cartella MaskFiles designata nella directory scelta. Lo schema di denominazione dei file maschera deve corrispondere ai singoli file di dati corrispondenti seguiti da "_mask_file". Ad esempio, se un file di dati è denominato "VAMP2_488_WT_1.tif", il file maschera corrispondente deve essere denominato "VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif".</li>
		<li>Utilizzare il pulsante Trova maskfiles per passare alla cartella scelta dei file maschera personalizzati depositati. Le maschere popoleranno i file maschera come elenco. NOTA: è importante disporre di una maschera per ogni file di dati prima di eseguire l'analisi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analisi ed estrazione delle feature
<ol><li>Dopo aver scelto la directory e popolato l'elenco File di dati e l'elenco File maschera, fare clic sul pulsante Analisi (Figura 4A). Se è richiesta la classificazione degli eventi esocitici, passare al passaggio 5. NOTA: il clic sul pulsante Analisi eseguirà una serie di attività automatizzate per analizzare i dati. Creerà singole cartelle nella directory scelta per depositare i dati analizzati. Durante l'esecuzione, l'"indicatore di corsa" cambierà da verde a giallo (Figura 4A, casella rossa). Al termine dell'analisi, questo tornerà in verde.</li>
	<li>Trovare una cartella DataFiles (Figura 4B) con il set completo di file di analisi (nonché i file di estrazione delle feature, da utilizzare nella classificazione successiva) denominati in base a ciascun file di dati (Figura 4C). NOTA: una descrizione di questi file di analisi è inclusa di seguito nella sezione Risultati rappresentativi.</li>
</ol>5. Classificazione degli eventi esocitici
<ol><li>Per eseguire la classificazione simultanea degli eventi esocitici con rilevamento automatico, selezionare la casella di controllo Classificazione prima di fare clic sul pulsante Analisi. Per ogni evento esocitico, assegna un punteggio di probabilità compreso tra 0-1 per ogni classe. Un evento esocitico è considerato classificato come una delle quattro classi se il punteggio di probabilità per quella classe è > 0,5. NOTA: una volta completata l'analisi, verrà visualizzata una nuova cartella di file di dati all'interno della directory scelta. La cartella conterrà i file di analisi corrispondenti a ciascun file di immagine.</li>
</ol>6. Analisi spaziotemporale dell'esocitosi utilizzando i valori K di Ripley
<ol><li>Creare un file maschera "neurite" e "soma" separato. In primo luogo, segmentare il soma dal neurite. Non esiste un metodo imparziale per segmentare il soma dai neuriti, quindi l'utente dovrebbe essere accecato dall'esperimento di condizionamento e usare il miglior giudizio; si suggerisce un ellissoide senza estensioni evidenti di neurite.</li>
	<li>Apri ImageJ/Fiji.</li>
	<li>Trascinare e rilasciare il file maschera o utilizzare File | Aprire e quindi selezionare il file maschera.</li>
	<li>Utilizzate lo strumento di selezione colore e fate clic su uno qualsiasi dei pixel neri sullo sfondo della maschera per impostare il colore su nero.</li>
	<li>Usa lo strumento di selezione dei poligoni o a mano libera per disegnare un contorno attorno al soma, separandolo dai neuriti. Ciò richiede un processo decisionale manuale.</li>
	<li>Fai clic su Modifica | | di selezione Crea maschera. Si aprirà una nuova immagine con il soma cerchiato segmentato dal resto dell'immagine. Questo creerà un file di maschera soma.</li>
	<li>Senza spostare la regione disegnata, fare clic sull'intestazione del file maschera originale.</li>
	<li>Fai clic su Modifica | Riempire per riempire il soma cerchiato in modo che solo i neuriti rimangano la maschera.</li>
	<li>Una volta ottenuti i file di neurite e maschera separati, salvare entrambi i file maschera.</li>
	<li>Apri "neurite_2D_network" in Matlab.</li>
	<li>In MATLAB, vai alla directory con tutti i dati di analisi.</li>
	<li>Modificare il percorso "nome maschera" con il nome della maschera neurite, ad es. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif"</li>
	<li>Modificare il "csv_file_name" in cui si trova fluorescent_traces.csv file, ad es. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv".</li>
	<li>Fare clic su Esegui per scheletrare il file della maschera di neurite. Questo crea una versione scheletrata del file maschera neurite e lo deposita come file CSV nella cartella maskfiles.</li>
	<li>Quindi, genera un file CSV per il soma. Apri "CSV_mask_creator.m" in Matlab.</li>
	<li>Inserisci il percorso per il "nome maschera" al nome della maschera soma, ad es. "MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif</li>
	<li>Cambia il "writematrix" in nome file csv da creare, ad es. "MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv"</li>
	<li>Fare clic su Esegui. In questo modo viene creato il nuovo file VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv.</li>
	<li>Ripetere la 6.14 per ogni file maschera.</li>
</ol>7. Configurazione di RStudio
<ol><li>Apri Rstudio e apri ripleys_k_analysis. R.</li>
	<li>Installa il pacchetto "spatstat" in RStudio andando su Strumenti | Installa pacchetti e digita "spatstat" seguito da Installa. NOTA: questo deve essere eseguito solo una volta per l'installazione di Rstudio.</li>
	<li>Eseguire lo spatstat della libreria all'inizio di ogni sessione.</li>
	<li>Presta attenzione a due variabili principali in questo caso: "neuron_mask" e "neuron_datapoints". Neuron Mask punta al set di file maschera da eseguire, cioè file maschera soma. NOTA: eseguire tutti i file della maschera soma insieme, separatamente dai file maschera neurite e viceversa.</li>
	<li>Leggi nella .csv dei file della maschera per ciascuno dei neuroni da analizzare.</li>
	<li>Esegui più file contemporaneamente copiando neuron_mask_n+1 aggiuntivi. Ciò consentirà di aggregare insieme l'analisi di Ripley, utilizzando lo script descritto nella sezione 8.</li>
	<li>Ora controlla la seconda variabile, "neuron_datapoints".</li>
	<li>Leggi nella." X_fluorescent_traces.csv" generato dal programma di analisi (dalle caratteristiche di tutti i extracted_R file) con le posizioni x,y,t degli eventi esocitici, nonché il file specifico del neurite delle posizioni x,y per la rete 2D. Questo va nella posizione "neuron_datapoints".</li>
	<li>In RStudio selezionare il codice | | dell'area di esecuzione Esegui tutto. Questo genera diversi grafici, inclusi i valori K di Ripley raggruppati e i grafici di densità.</li>
	<li>Salva i grafici andando su Esporta | Salva immagine con nome | Selezionare il formato immagine e la directory appropriati e immettere il nome file appropriato, quindi fare clic su Salva. NOTA: la funzione di plottaggio per le mappe di calore viene chiamata nello script usando "plot(density(soma_data,0.4))". Il numero "0.4" qui rappresenta quanto dovrebbe essere appianata la funzione di densità. Può essere modificato per adattarsi ai dati dell'utente in modo significativo, ma se devono essere eseguiti confronti tra diverse mappe di calore, il numero deve essere lo stesso tra di loro.</li>
	<li>
Esporta o salva l'immagine da Rstudio. Se una mappa di calore richiede ulteriori modifiche, scegli un tipo di file appropriato (SVG o EPS).</li>
</ol>8. L'analisi di Ripley
NOTA: il Ripleys_k_analysis. Il file R generava automaticamente anche i grafici del valore k di Ripley. L'esecuzione dell'intero script eseguirà automaticamente le funzioni menzionate di seguito, ma è incluso in dettaglio se si desidera eseguire ogni parte dello script individualmente o apportare modifiche all'analisi.
<ol><li>Innanzitutto, eseguire la funzione di inviluppo per ogni cella. Questa funzione ha simulato la randomità spaziale completa (CSR) per testare il valore K di Ripley del modello del punto di evento esocitico rispetto a. Data_envelope_1 = envelope(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE) Data_envelope_2 = envelope(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)</li>
	<li>Quindi, raggruppa queste buste e crea una stima della CSR per il gruppo: Pool_csr = pool(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...) Quindi, eseguire la funzione K di Ripley per tutti i punti dati. Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, rapporto = VERO) Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, ratio = TRUE)</li>
	<li>Una volta completato, raggruppare i valori K di Ripley e avviare i relativi intervalli di confidenza con il seguente comando: Pool di dati = pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)</li>
	<li>Bootstrap con il seguente comando: Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool)</li>
	<li>Traccia i dati.</li>
	<li>Se è richiesta una differenza statistica difficile, Studentised Permutation Test è incluso nel pacchetto spatstat per testare una differenza tra gruppi di modelli di punti: Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ group, nperm = np).</li>
</ol>

<ol><li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).</li>
<li>Urbina, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM67+regulates+exocytic+mode+and+neuronal+morphogenesis+via+SNAP47%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47.</a> Cell Reports. 34 (6), 108743(2021).</li>
<li>Alabi, A. A., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+kiss-and-run%3A+Role+in+exocytosis%2C+endocytosis%2C+and+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission.</a> Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li>
<li>He, L., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+debate+on+the+kiss-and-run+fusion+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The debate on the kiss-and-run fusion at synapses.</a> Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).</li>
<li>Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+patch+clamp+reveals+that+transient+fusion+%28kiss-and-run%29+is+a+major+mechanism+of+secretion+in+calf+adrenal+chromaffin+cells%3A+high+calcium+shifts+the+mechanism+from+kiss-and-run+to+complete+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion.</a> Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030(2006).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+single-vesicle+astrocyte+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).</li>
<li>Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+direct%2C+dynamin-dependent+recapture+of+fusing+secretory+granules+on+plasma+membrane+lawns+from+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).</li>
<li>Wang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+domains+of+synaptotagmin+control+the+choice+between+kiss-and-run+and+full+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion.</a> Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).</li>
<li>Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+combined+methodologies+to+define+the+role+of+plasma+membrane+delivery+during+axon+branching+and+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53743(2016).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+primary+culture+of+embryonic+mouse+hippocampal+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).</li>
<li>Plooster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM9-dependent+ubiquitination+of+DCC+constrains+kinase+signaling%2C+exocytosis%2C+and+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).</li>
<li>Urbina, F. L., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-mediated+exocytosis+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SNARE-mediated exocytosis in neuronal development.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133(2020).</li>
<li>Ripley, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second-order+analysis+of+stationary+point+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Probability%22%5BJournal%5D)">The second-order analysis of stationary point processes.</a> Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).</li>
<li>Liu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHmScarlet+is+a+pH-sensitive+red+fluorescent+protein+to+monitor+exocytosis+docking+and+fusion+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps.</a> Nature Communication. 12 (1), 1413(2021).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano nulla da divulgare.

Quando si utilizza il software di rilevamento e analisi esocitica, si prega di considerare che il programma accetta solo la compressione senza perdita di dati .tif file come input. I file di immagine .tif possono essere immagini in scala di grigi (canale singolo) a 8 bit, 16 bit o a 32 bit. Altri formati di immagine devono essere convertiti in uno di questi tipi prima dell'input. Per riferimento, gli esempi utilizzati qui sono immagini in scala di grigi a 16 bit.
Inerenti al processo di rileva...

I costrutti VAMP-pHluorin o i costrutti del recettore della transferrina (TfR)-pHuji sono eccellenti marcatori di eventi esocitici, poiché questi fluorofori sensibili al pH vengono spenti all'interno del lume della vescicola acida e fluoresceno immediatamente dopo l'apertura del poro di fusione tra la vescicola e la membrana plasmatica1. Dopo l'apertura dei pori di fusione, la fluorescenza decade in modo esponenziale, con una certa eterogeneità che rivela informazioni sull'evento di fusione. Qui viene descritta un'applicazione di interfaccia utente grafica (GUI) che rileva e analizza automaticamente gli eventi esocitici. Questa applicazione consente all'utente di rilevare automaticamente gli eventi esocitici rivelati dai marcatori sensibili al pH2 e generare caratteristiche da ciascun evento che possono essere utilizzate ai fini della classificazione3 (Figura 1A). Inoltre, viene descritta l'analisi del clustering di eventi esocitici utilizzando la funzione K di Ripley.
La classificazione automatizzata degli eventi esocitici in diverse modalità esocitiche è stata recentemente riportata3. Due modi di esocitosi, fusione completa vescicolare (FVF) ed esocitosi da fusione kiss-and-run (KNR) sono stati precedentemente descritti4,5,6,7. Durante la fecondazione in vitro, il poro di fusione si dilata e la vescicola viene incorporata nella membrana plasmatica. Durante KNR, il poro di fusione si apre transitoriamente e poi risigilla4,5,8,9,10. Sono state identificate quattro modalità di esocitosi nello sviluppo dei neuroni, due relative alla FVF e due correlate alla KNR. Questo lavoro dimostra che sia FVF che KNR possono essere ulteriormente suddivisi in eventi di fusione che procedono immediatamente al decadimento della fluorescenza (FVFi e KNRi) dopo l'apertura dei pori di fusione o eventi esocitici che mostrano un ritardo dopo l'apertura dei pori di fusione prima dell'inizio del decadimento della fluorescenza (FVFd e KNRd) (Figura 1B). Il classificatore identifica la modalità di esocitosi per ogni evento di fusione. Qui questa analisi è stata incorporata in una GUI che può essere installata in MATLAB in sistemi operativi basati su Windows e Mac. Tutti i file di analisi sono disponibili all'https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing o https://github.com/GuptonLab.

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td></tr><tr><td>il team</td><td></td> principale <td>di</td> <td>R</td> R https://www.r-project.org/</tr> <tr><td>Rstudio</td><td>Rstudio, PBC</td><td></td><td>https://rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

rilevamento e analisi automatizzati dell'esocitosi

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

La microscopia TIRF timelapse di GFP pH-sensibile (pHluorin) attaccata alle proteine SNARE delle vescicole è un metodo efficace per visualizzare gli eventi esocitici delle singole vescicole in coltura cellulare. Per eseguire un'identificazione e un'analisi imparziali ed efficienti di tali eventi, è stato sviluppato e implementato in MATLAB un approccio basato sulla visione artificiale. La pipeline di analisi è costituita da una segmentazione cellulare e da un algoritmo di identificazione degli eventi esocitici. L'approccio di visione artificiale include strumenti per lo studio di più parametri di singoli eventi, tra cui l'emivita del decadimento di fluorescenza e il picco ΔF / F, nonché l'analisi a cellule intere della frequenza dell'esocitosi. Questi e altri parametri di fusione sono utilizzati in un approccio di classificazione per distinguere modalità di fusione distinte. Qui una GUI di nuova costruzione esegue la pipeline di analisi dall'inizio alla fine. Un ulteriore adattamento della funzione K di Ripley in R Studio viene utilizzato per distinguere tra evento di fusione raggruppato, disperso o casuale sia nello spazio che nel tempo.

Qui la GUI (Figura 2A) è stata utilizzata per analizzare gli eventi esocitici di tre neuroni che esprimono VAMP2-pHluorina a 3 DIV utilizzando la microscopia TIRF (total internal reflection fluorescence). I neuroni corticali E15.5 sono stati isolati, seguiti da trasfezione con VAMP2-pHluorin e placcatura utilizzando i protocolli come delineato in Winkle et al., 2016 e Viesselmann et al., 201111,12. La metodologia dei parametri di ima...

Abbiamo sviluppato un software automatizzato di visione artificiale per rilevare eventi esocitici contrassegnati da sonde fluorescenti sensibili al pH. Qui, dimostriamo l'uso di un'interfaccia utente grafica e RStudio per rilevare eventi di fusione, analizzare e visualizzare i parametri spaziotemporali di fusione e classificare gli eventi in modalità di fusione distinte.

Rilevamento e analisi automatizzati dell'esocitosi

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...

Il software Automated Detection and Analysis Of Exocytosis consentirà all'utente di rilevare automaticamente eventi esocitici e sequenze di immagini TIRF di fluorofori sensibili al pH. Produrrà anche automaticamente caratteristiche di esocitosi come la distribuzione spaziale o la frequenza, nonché proprietà individuali di eventi esocitici, come l'emivita o il cambiamento di fluorescenza sullo sfondo. Inoltre, è inclusa un'opzione per classificare gli eventi esocitici in quattro modalità di esocitosi, precedentemente descritte in letteratura.Per utilizzare il software di rilevamento e analisi automatizzati dell'esocitosi, per prima cosa farai clic sul pulsante Trova set di dati e navigherai verso dove sono depositati i tuoi dati e ti consigliamo di inserire una cartella chiamata dati grezzi. I tuoi file di dati popoleranno automaticamente l'elenco qui e potrai avere un numero qualsiasi di file di dati in questa cartella. Successivamente, ti consigliamo di scegliere una directory per la quale verranno depositati i tuoi file di analisi.Qui, ho scelto una directory chiamata test. Ti consigliamo anche di inserire la frequenza dei fotogrammi delle tue immagini e la dimensione dei pixel. Qui i miei frame rate sono di cento millisecondi per fotogramma, la mia dimensione dei pixel è di otto nanometri.Infine, avrai bisogno di file maschera per eseguire il software di rilevamento e analisi automatizzati dell'esocitosi. È possibile utilizzare il pulsante di creazione di maschere incluso per generare automaticamente file di maschera dai file di dati. L'indicatore di corsa diventerà giallo e poi tornerà in verde quando il produttore di maschere avrà finito di funzionare.La maschera verrà depositata in una nuova cartella chiamata file maschera nella directory scelta. E nota, i file maschera popoleranno automaticamente l'elenco qui. Ti consigliamo di verificare che i tuoi file di maschera siano fatti in modo appropriato per i tuoi file di dati e puoi farlo evidenziando uno qualsiasi dei file di dati nell'elenco, così come il file di maschera corrispondente.Verrà visualizzato il primo fotogramma del file di dati e verrà visualizzato anche il file maschera selezionato. Qui. Possiamo vedere che i nostri file di maschera sono appropriati per l'analisi a portata di mano. I file maschera possono anche essere forniti dall'utente separatamente.Quando si desidera creare un file maschera da un file di dati corrente, si consiglia di utilizzare Image J.In per farlo, aprire prima l'immagine nell'immagine J da cui si desidera creare un file maschera. È quindi possibile utilizzare lo strumento di selezione del poligono per iniziare a creare un file maschera facendo clic attorno al bordo della cella. Una volta completata la maschera, fare doppio clic per connettersi all'intero poligono.Una volta completato, andrai a modificare, selezionare e creare maschera. Verrà creata una maschera invertita. Si desidera salvare questo file maschera utilizzando lo stesso nome del file di dati seguito da _mask_file.Ora, se fornisci i tuoi file di maschera personalizzati, è importante far sapere al software di rilevamento automatico dove si trovano quei file di maschera. Per fare ciò, fare clic sul pulsante Trova file maschera e passare alla directory con i file maschera al suo dentro. I nuovi file maschera popoleranno quindi l'elenco qui.È importante disporre di una maschera per ogni singolo file di dati prima che l'analisi possa essere eseguita. Ora, una volta caricato il set di dati, i file della maschera, la frequenza dei fotogrammi e la dimensione dei pixel regolati correttamente e una directory scelta, è finalmente possibile decidere se si desidera includere la classificazione come parte dell'analisi. Se si attiva il pulsante di classificazione, oltre a rilevare eventi esocitici, ogni evento esocitico verrà classificato in una delle quattro classi.Una volta deciso il modo in cui eseguire l'analisi, è possibile iniziare l'analisi facendo clic sul pulsante di analisi. L'indicatore di esecuzione diventerà giallo per indicare che l'analisi è in corso e tornerà in verde al termine dell'analisi. Una volta completata l'analisi, come indicato dall'indicatore di esecuzione che cambia da giallo a verde, noterai che una nuova cartella di file di dati è apparsa all'interno della directory scelta.All'interno della cartella dei file di dati, troverai i file di analisi corrispondenti a ciascun set di immagini nell'esecuzione dell'analisi. Inoltre, un file di statistiche cellulare contenente informazioni di riepilogo come la frequenza di esocitosi per ciascuno dei set di immagini è qui. Per ogni set di immagini, si dispone di un file di tracce fluorescenti, che contiene informazioni sulla posizione X, la posizione Y e il numero di fotogramma per il luogo in cui si verificano eventi esocitici.Inoltre, la fluorescenza media in una regione di interesse intorno a ciascun evento esocitico viene presentata sia prima, durante e dopo l'esocitosi. Inoltre, c'è anche un file di tracciamento, che contiene informazioni simili delle posizioni X, Y e temporali. Tuttavia, se la casella di controllo di classificazione è selezionata, inoltre, ci saranno quattro colonne aggiuntive, che indicano la probabilità dell'evento esocitico appartenente a una delle quattro classi.O fusione completa della vescicola istantanea, fusione completa delle vescicole ritardata, bacio e corsa istantanea o bacio e corsa ritardata. Un evento esocitico appartiene a una delle quattro classi se è maggiore di 0,5 ed è la più alta probabilità all'interno delle quattro classi governate. In questo caso, il primo evento esocitico qui appartiene alla classe istantanea di fusione completa delle vescicole, in quanto è il numero più alto sopra le quattro classi ed è maggiore di 0,5.Inoltre, ci sono una serie di altri file di funzionalità per ogni set di immagini, che vengono utilizzati durante la classificazione dell'esocitosi e possono essere di interesse per ulteriori analisi. Infine, se vogliamo utilizzare l'analisi K di Ripley per rilevare l'organizzazione spazio-temporale dell'esocitosi, inizieremo prima dividendo il nostro file maschera in un file maschera neurite e un file maschera soma. Lo faremo aprendo prima la nostra maschera in Image J.Vorremo usare il selettore di colori per selezionare un pixel di sfondo.E in questo modo, quando riempiamo il file della maschera, è il valore corretto. Successivamente useremo lo strumento di selezione dei poligoni e delineeremo la regione somatica. Ora questo richiede un po 'di processo decisionale soggettivo e manuale.suggeriamo un ellissoide ruvido. Una volta completato, andrai a modificare, selezionare e creare maschera. Infine, tornerai al nostro file maschera originale e utilizzerai modifica e compila per riempire il soma, e ora abbiamo un file separato di neurite e maschera soma, che salverai.Una volta salvato il file separato di neurite e soma mask, qui, l'ho come neur di underscore del file maschera per neurite e underscore soma, verremo su MATLAB e apriremo il file MATLAB di rete 2D di neuriti. Qui, navigheremo nella cartella corrente nella nostra directory dove abbiamo depositato tutti i nostri dati di analisi. Una volta fatto ciò, avremo quindi cambiato il percorso del nome della maschera nel nostro nuovo file maschera che è il neurite.Quindi, in questo caso, ho il mio file di maschera di neurite nella cartella dei file della maschera. Cambieremo quindi il nome del file CSV in cui si trova il nostro file di tracce fluorescenti. In questo caso, è ancora nella cartella dei file di dati, quindi la barra dei file di dati e il nome del file CSV delle tracce fluorescenti.Una volta completato, puoi quindi premere run. Questo creerà quindi una versione scheletrata del file della maschera neurite e lo depositerà come file CSV nella cartella dei file maschera, che possiamo vedere qui. Successivamente genereremo anche un file CSV per il soma.A tale scopo, apri il file csv mask creator. Ti consigliamo di inserire il percorso per la tua maschera soma e un nome per il file CSV da creare. Qui sono andato avanti e ho usato lo stesso nome file esatto, solo con il punto CSV aggiunto.Premi run e vedrai che un nuovo file CSV soma è stato creato insieme al neurite. Una volta creati i file CSV sia per la maschera di neurite che per la maschera soma, possiamo eseguire l'analisi K di Ripley. Per fare ciò, navigheremo su R Studio e apriremo il file Ripley's K analysis R.Ci sono due variabili principali a cui prestare attenzione, la maschera neuronale e i punti dati neuronali. La maschera neuronale punterà a qualsiasi file maschera che si desidera eseguire. In questo caso, sto prima eseguendo i file della maschera soma.Ti consigliamo di eseguire tutti i tuoi file di maschera soma separatamente da tutti i tuoi file di maschera di neurite. Qui, ho due neuroni, che utilizzerò per questa analisi. Tuttavia, puoi usarne quanti ne vuoi per l'analisi K di Ripley, ti consigliamo solo di copiare e incollare questo codice per la maschera neuronale e cambiare la variabile in tre e oltre.La seconda variabile sono i punti dati neuronali. Qui vuoi indirizzarlo al file che è stato generato dalle tue funzionalità tutto il file R estratto. Ora il mio è stato chiamato fusion stats, e quindi questo è ciò che sta leggendo qui.Come accennato, ho un secondo file di maschera soma e neurone, che viene analizzato insieme in modo da poter aggregare il K di Ripley insieme. Dopo aver modificato questi percorsi con il percorso corretto, si utilizzerà il codice, l'area di esecuzione e l'esecuzione di tutto. Al termine dell'esecuzione, verranno generati diversi grafici, inclusi i valori K di Ripley raggruppati e i grafici di densità.Questi possono essere salvati andando a esportare, salvare l'immagine come e scegliendo il formato di immagine appropriato, la directory, il nome del file e infine premendo salva. Qui vediamo i risultati rappresentativi di 12 neuroni corticali murini che esprimono lo sfiato al fluoro ripresi a due giorni in vitro utilizzando la microscopia TIRF. In A, vediamo la frequenza dell'esocitosi divisa per classe.Qui possiamo vedere che la fusione istantanea completa delle vescicole si verifica più frequentemente rispetto alle altre classi. In B, possiamo vedere la distribuzione del modo, confermando che la fusione completa delle vescicole istantanea costituisce più della metà di tutti gli eventi. In C determiniamo la distribuzione spaziale dell'esocitosi come mappa di calore.Possiamo vedere che la maggior parte degli eventi esocitici sono raggruppati in un hotspot vicino al soma, così come alle estremità distali dei neuriti. In D possiamo determinare che gli eventi esocitici sono raggruppati statisticamente in modo significativo e che la dimensione di questi cluster varia da mezzo micron a un micron di dimensione. L'uso di un programma di analisi automatizzato per identificare e analizzare correttamente gli eventi esocitici in modo imparziale aumenta l'efficienza dell'analisi e migliora la riproducibilità e il rigore.Per garantire l'accuratezza del rilevamento, è importante mantenere un segnale elevato al rumore durante l'imaging. L'acquisizione di eventi esocitici o altri eventi transitori sensibili al pH richiede una frequenza di imaging abbastanza veloce da catturare tutti gli eventi e migliorare stime come l'emivita o la variazione di picco della fluorescenza. Abbiamo dimostrato che non solo questo programma funziona per catturare con precisione la fluorescenza sensibile al pH nei neuroni in via di sviluppo, ma anche altri tipi di cellule.Tuttavia, se si utilizza un altro tipo di cella, è importante verificare le differenze di accuratezza, a causa dei comportamenti distinti di eventi transitori in altri tipi di cellule. Questa classificazione è stata utilizzata solo nello sviluppo di neuroni fino ad oggi. E in effetti non sappiamo che questi processi esistono in altri tipi di cellule o in momenti di sviluppo successivi nei neuroni.

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Questo video mostra una tecnica per visualizzare l'esocitosi nei mastociti. Le cellule sono incubate con FITC-destrano, un reporter fluorescente, che viene assorbito dalle cellule all'interno di granuli secretori (SG), dove il pH acido spegne la sua fluorescenza. Dopo la stimolazione dell'esocitosi dei granuli, il pH più elevato del mezzo induce la fluorescenza reporter all'interno degli SG fusi, che viene visualizzata utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Una tecnica in vitro per visualizzare l'esocitosi dei granuli secretori nei mastociti

Endocitosi mediata dalla clatrina, un processo rapido e altamente dinamico, internalizza molte proteine, compresi i recettori di segnalazione. Il protocollo qui descritto visualizza direttamente la cinetica dei singoli eventi endocitici. Questo è essenziale per capire come i membri principali del macchinario endocitico si coordinano tra loro e come il carico proteico influenza questo processo.

Visualizzazione Clathrin endocitosi mediata da G recettori accoppiati a proteine ​​a risoluzione singolo evento tramite microscopia TIRF

Esistono molti metodi diversi per la misurazione delle vescicole extracellulari (EV) con citometria a flusso (FCM). Molti aspetti devono essere considerati nella determinazione del metodo più appropriato da utilizzare. Due protocolli per i veicoli elettrici di misurazione sono presentate, utilizzando il rilevamento individuo o di un approccio basato tallone-.

Tecniche per l&#39;Analisi dei extracellulare vescicole citometria a flusso

L'obiettivo del presente protocollo è stato quello di sviluppare un metodo che permetterà analisi di genomica funzionale della secrezione mastociti. Il protocollo si basa sulla valutazione quantitativa del rilascio di un gene reporter fluorescente cotrasfected con il gene di interesse e l'analisi in tempo reale della morfologia del granulo secretorio.

Indagare Mast Cellula secretoria Granuli; dal Biosintesi a Esocitosi

Endocitosi delle vescicole sinaptiche sono rilevato da microscopia chiara di pHluorin fuso con proteine delle vescicole sinaptiche e da microscopia elettronica dell'assorbimento della vescicola.

Endocitosi delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni ippocampali di misura

Lo stress osmotico colpisce esocitosi e la quantità di neurotrasmettitore rilasciato durante questo processo. Dimostriamo come combinando metodi elettrochimici insieme con microscopia elettronica di trasmissione può essere utilizzato per studiare l'effetto della pressione osmotica extracellulare per attività di esocitosi, vescicola quantal dimensione e la quantità di neurotrasmettitore rilasciato durante esocitosi.

L'effetto di Stress osmotico su vescicole secretorie ed esocitosi di monitoraggio

Qui abbiamo dettaglio un metodo per l'imaging di cellule vive di esocitosi regolata. Questo metodo utilizza FITC-Destrano, che si accumula in organelli lisosoma-correlati, come reporter. Questo semplice metodo permette anche di distinguere tra diverse modalità di esocitosi regolata in cellule che sono difficili da manipolare geneticamente.

FITC-Destrano di imaging come Reporter per esocitosi regolata

Fagosoma, la rimozione fagocitica delle cellule apoptotiche, è necessaria per mantenere l'omeostasi ed è facilitata dalla recettori e vie di segnalazione che consentono il riconoscimento, il engulfment e interiorizzazione delle cellule apoptotiche. Qui, presentiamo un protocollo di microscopia di fluorescenza per la quantificazione del fagosoma e l'attività delle vie di segnalazione efferocytic.

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

L'imaging vivo dell'esocitosi lisosomica sulle cellule micromodelle consente una quantificazione spaziale di questo processo. La normalizzazione della morfologia tramite micromodelli è uno strumento eccezionale per scoprire le regole generali sulla distribuzione spaziale dei processi cellulari.

Quantificazione dei parametri Spatiotemporal dell'esocitosi cellulare nelle cellule micromodellate

Questo protocollo descrive gli approcci per il rilevamento e la quantificazione di grandi estrusioni aggregate e/o organelle (4 m) prodotte dalle cellule C. elegans sotto forma di esopher legati alla membrana. Descriviamo i ceppi, le condizioni di crescita, i criteri di punteggio, i tempi e le considerazioni di microscopia necessarie per facilitare la dissezione di questo meccanismo di espulsione dei detriti.

Approcci quantitativi per il punteggio in vivo Neuronal Aggregate e Organelle Extrusion in Grandi Vesicles esopher in C. elegans

Scopri un software automatizzato per rilevare eventi esocitotici in sequenze di immagini TIRF con fluorofori pH-sensibili. Classifica quattro modalità di fusione e analizza la distribuzione spaziale con Ripley's K.

Rilevamento e analisi automatizzati dell'esocitosi

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