Name: 인간 단세포와 같은 THP-1 백혈병 세포선을 사용하여 M2와 같은 표현형으로 대식세포 분화 및 편광 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 배우세요 THP-1 세포를 M2 대식세포로 14일 내 분화 및 편극하는 방법을. 이 프로토콜은 종양 미세환경에서 항염증성 거대식세포 기능을 연구하는 재현 가능한 모델을 제공합니다.

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외과 연구의 가격 연구소, 루이빌 대학, 재정적으로 존 W. 가격과 바바라 스러스턴 앳우드 가격 신탁에 의해 지원됩니다. 자금 출처는 연구의 설계 및 수행뿐만 아니라 데이터의 수집, 관리, 분석 및 해석에 아무런 역할이 없었습니다.

참고: 이 프로토콜에 설명된 단계에 대한 개요는 그림 1에표시됩니다. 인간 단세포종 백혈병 세포주 THP-1을 구입했다. THP-1 세포주 인증을 위해 짧은 탠덤 반복 분석이 수행되었다. 멸균 조건에서 모든 단계를 수행합니다. THP-1 단낭세포선은 현탁액에서 자라며 세포 배양 표면에 부착하지 않습니다. 준수는 예를 들어, 기계적 응력 또는 PMA를 통한 특정 처리를 통해 대식세포와 같은 세포로 단핵구를 분화시킴으로써 유도될 수있다.
1. THP-1 단세포와 같은 세포의 배양 및 유지 보수
<ol><li>타이머를 150s로 설정합니다. 액체 질소로부터 THP-1세포주(재료표)를함유한 냉동 유리알을 제거하고 깨끗한 수조(37°C)에서 즉시 해동한다. 바이알을 수조에 넣으면마자 타이머를 시작합니다. 해동 공정으로 인해 쌓이는 압력을 방출하기 위해 캡을 풀지만 튜브 개구부가 물에 닿지 않도록 하여 오염을 방지합니다. 세포를 해동하기위한 최적의 기간은 120-150 s 사이입니다. 약 4mm 크기의 얼음 칩이 유리병 내에 남아있을 때까지 셀 서스펜션을 계속 해동; 그런 다음 즉시 다음 단계로 진행하십시오.</li>
	<li>세포 현탁액의 액체 상을 따뜻한 (37 °C) 성장 매체(재료표)의9 mL을 포함하는 15 mL 튜브로 전송합니다. 이어서, 따뜻한 중간세포 현탁액의 1mL를 THP-1 바이알로 다시 15mL 튜브로 이송하여 남은 얼음 칩을 녹이고 유리병을 플러시하여 세포가 남지 않도록 한다.</li>
	<li>1000 μL 파이펫으로 위아래로 피펫을 하여 서스펜션을 부드럽게 섞습니다. 작은 샘플(약 10μL)을 제거하여 셀을 셀에 계산하여 실행 가능성을 계산합니다(제외를 위해 트라이팬 블루를 사용). 37°C에서 7분 동안 200 x g의 따뜻한 셀 서스펜션을 회전시.</li>
	<li>상체를 완전히 제거하고 5 x 10 5/mL의 세포 밀도를 달성하기위해 특정 양의 따뜻한 성장 매체로 재축한다. 서스펜션을 부드럽게 혼합하고 22mL의 부피를 T-75 세포 배양 플라스크(재료표)로옮기다. 37°C의 인큐베이터에 5%의이산화탄소(CO2)농도를 저장하는 플라스크를 저장합니다. 성장 미디어를 3-4일마다 교환합니다.</li>
</ol>2. THP-1 세포의 파종 및 M0 대식세포로 분화
<ol><li>3 x 10 5/mL/웰의 밀도에서 종자 세포에각각의 세포 밀도를 함유한 성장 배지를 함유하는 세포를 24웰 세포 배양플레이트(재료표)로준비한다. 매체를 부드럽게 섞고 26mL의 알리쿼트를 준비하여 각각 50mL 튜브에 넣습니다. 각 26mL 알리쿼트에서 세포를 각 플레이트로 시드한다.</li>
	<li>24웰 플레이트의 각 웰에 세포 함유 배지의 1mL를 전달한다. 전송 사이에 위아래로 파이프를 하여 미디어를 부드럽게 섞습니다.</li>
	<li>PMA의 재고 용액(디메틸 설플산화물 100μl에 PMA 1 mg을 용해하여 디메틸 설플산화물(DMSO)= DMSOPMA의 ~16mMM 솔루션) 및 감기 인산완충식칼린(PBS)으로 희석하여 세포 처리 직전 10ng/μL의 최종 작동농도(재료표)로희석한다. 얼음에 용액을 유지하고 즉시 사용하십시오. 다시 고정하지 마십시오. 잘 당 PMA의 100 ng를 추가합니다. 각 세포판이 72h에 대한 추가 치료없이 인큐베이터에 앉게하십시오.</li>
	<li>72h 후, 성장 매체를 제거하고 신선한 성장 매체의 1 mL로 대체합니다. 파이펫 팁으로 우물 바닥을 만지지 마십시오. 세포가 인큐베이터에서 또 다른 96 h를 위해 쉬게하십시오.</li>
	<li>96h 후, 2.4단계(미디어 변경)를 반복하고 세포가 다른 24시간 동안 쉬게 한다. 참고: M0 대식세포는 이제 실험에 사용할 준비가되었습니다(그림 2). 추가 실험의 일환으로 세포를 치료하기 직전에 성장 미디어 보충제는 세포치료를 위해 첨가되는 시약과의 간섭을 일으킬 수 있기 때문에 RPMI(재료 표)만으로 미디어 변화를 고려하십시오. M2와 같은 대식세포가 필요한 경우 3절을 진행하십시오.</li>
</ol>3. M0 대식세포의 편광을 M2와 같은 대식세포로 편광
<ol><li>IL-4 및 IL-13의 재고 용액을 준비(IL-4 또는 IL-13의 200μL에 뉴클레아제없는물의 200 μL)를 준비하고 세포 처리 직전에 PBS로 2 ng/μL의 최종 작동 농도로 희석한다. 얼음에 용액을 유지하고 즉시 사용하십시오. 다시 고정하지 마십시오.</li>
	<li>성장 매체를 제거하고 신선한 성장 매체의 1 mL로 대체하십시오. 인터류신 4(IL-4)의 20ng과 인터류빈 13(IL-13)의 20ng를 잘 넣습니다. 세포가 인큐베이터에서 48h 동안 쉬게 하십시오.</li>
	<li>48h 후, 3.2 단계를 반복합니다. 세포가 인큐베이터에서 또 다른 48 h를 위해 쉬게하십시오.</li>
	<li>성장 매체를 제거하고 신선한 성장 매체의 1 mL로 대체하십시오. 세포가 인큐베이터에서 48h 동안 쉬게 하십시오. 참고: M2와 같은 대식세포는 이제 실험에 사용할 준비가되었습니다(그림 2). 추가 실험의 일환으로 세포를 치료하기 직전에 성장 미디어 보충제가 간섭을 일으킬 수 있으므로 RPMI(재료표)만으로미디어 변경을 고려하십시오.</li>
</ol>4. 유동 세포측정을 위한 대식세포 분리 및 수확
참고: 차가운 충격과 세포 스크래핑을 결합하여 유동 세포측정을 위해 플레이트에서 편광 된 대식세포를 분리하고 수확하는 기계적 방법을 사용합니다.
<ol><li>따뜻한 세포 매체를 제거하고 얼음 차가운 PBS (칼슘과 마그네슘제외)와 5 % 태아 소 혈청 (FBS), 우물 당 1 mL의 혼합물로 대체하십시오. 이 직후, 45 분 동안 얼음에 세포 판을 놓습니다. 이 세포 생존을 크게 감소하기 때문에, 따뜻한 세포 매체가 제거되기 전에 얼음에 세포 판을 배치하지 마십시오. 얼음 차가운 PBS / 5 % FBS 혼합물로 차가운 충격을 유도 한 후에만 세포를 얼음에 보관하십시오.</li>
	<li>얼음에 45 분 후, 미니 셀 스크레이퍼(재료의 표)를사용하여 세포를 긁어. 차가운 PBS/5% FBS에서 분리된 대식세포를 15mL 튜브로 부드럽게 전송합니다. 세포가 얼룩될 때까지 항상 튜브를 얼음 에 보관하십시오. 참고: 염색에 적합한 세포 수에 도달하기 위해 8개의 우물을 풀링합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+enhance+tumor-associated+macrophages+enrichment+and+suppress+NK+cells+function+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 273(2019).</li>
<li>Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+cancer+and+immune+cells%3A+Role+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).</li>
<li>Soncin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+creates+a+niche+for+the+self-renewal+of+tumor-promoting+macrophages+in+colon+adenoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma.</a> Nature Communications. 9 (1), 582(2018).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+TAM+functions-it+takes+two+to+tango%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Biochemical+Societies+Journal%22%5BJournal%5D)">Metabolism and TAM functions-it takes two to tango.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).</li>
<li>Eum, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-promoting+macrophages+prevail+in+malignant+ascites+of+advanced+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).</li>
<li>Qian, B. Z., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+diversity+enhances+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis.</a> Cell. 141 (1), 39-51 (2010).</li>
<li>Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O'Brien, S. J., Galandiuk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+dysfunction+and+early-onset+colorectal+cancer+-+how+macrophages+build+the+bridge%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer - how macrophages build the bridge.</a> Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).</li>
<li>Bosshart, H., Heinzelmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THP-1+cells+as+a+model+for+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">THP-1 cells as a model for human monocytes.</a> Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438(2016).</li>
<li>The American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation">https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation</a> (2021).</li>
<li>Baxter, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+protocols+for+differentiation+of+THP-1+cells+to+macrophages+with+distinct+M%28IFNgamma%2BLPS%29%2C+M%28IL-4%29%2C+and+M%28IL-10%29+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes.</a> Journal of Immunological Methods. 478, 112721(2020).</li>
<li>Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1+and+M2+macrophages+derived+from+THP-1+cells+differentially+modulate+the+response+of+cancer+cells+to+etoposide%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide.</a> BMC Cancer. 15, 577(2015).</li>
<li>Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phorbol+12-myristate-13-acetate+differentiation+protocol+is+critical+to+the+interaction+of+THP-1+macrophages+with+Salmonella+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium.</a> PLoS One. 13 (3), 0193601(2018).</li>
<li>Lund, M. E., To, J., O'Brien, B. A., Donnelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choice+of+phorbol+12-myristate+13-acetate+differentiation+protocol+influences+the+response+of+THP-1+macrophages+to+a+pro-inflammatory+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus.</a> Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6%2FSTAT3+pathway+intermediates+M1%2FM2+macrophage+polarization+during+the+development+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).</li>
<li>O'Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itaconate%3A+the+poster+child+of+metabolic+reprogramming+in+macrophage+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).</li>
<li>Luig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-induced+IL-6+functions+as+a+natural+brake+on+macrophages+and+limits+gn%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).</li>
<li>Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+macrophage+function+-+cyclic+tensile+force+inhibits+NLRP3+inflammasome-dependent+IL-1beta+secretion+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of macrophage function - cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages.</a> Inflammation and Regeneration. 39, 3(2019).</li>
<li>Gatto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PMA-Induced+THP-1+Macrophage+Differentiation+is+Not+Impaired+by+Citrate-Coated+Platinum+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles.</a> Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).</li>
<li>Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li>
<li>Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+markers+of+macrophage+differentiation+in+PMA-stimulated+THP-1+cells+and+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages.</a> PLoS One. 5 (1), 8668(2010).</li>
<li>Raggi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+macrophage+M1-M2+polarization+balance+by+hypoxia+and+the+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1.</a> Frontiers in Immunology. 8, 11097(2017).</li>
<li>Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+mild+cold+shock+%2825+degrees+C%29+followed+by+warming+up+at+37+degrees+C+on+the+cellular+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response.</a> PLoS One. 8 (7), 69687(2013).</li>
<li>Kurashina, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-free+release+of+adhered+cells+from+standard+culture+dishes+using+intermittent+ultrasonic+traveling+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves.</a> Communications Biology. 2, 393(2019).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Bailey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+murine+bone+marrow-derived+macrophages+for+nitric+oxide+and+redox+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology.</a> Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).</li>
</ol>

저자는 잠재적 이해 상충을 선언하지 않습니다.

14일 이내에 THP-1 단세포와 같은 세포를 분화하고 편광하는 이 프로토콜은 단계 사이에 적절한 휴식 기간을 가진 세포의 긴 치료 배양으로 인해 뚜렷한 M2 와 같은 표현형으로 대식세포를 얻는 방법을 제공한다.
특정 단계는 이 프로토콜에 매우 중요합니다. THP-1 단핵구의 두 배 시간은 약 26h입니다. 세포는 9 x 10 5/mL의 세포 밀도로 분할될 수 있으며 모든 분할 동안 3 x 105/mL의밀도로 시드되어야 합니다. 분할은 모든 사용된 (오래된) 세포 매체를 제거하지 않고 수행 될 수있다 - 신선한 배지의 단지 50 %로 세포를 재공급하는 것은 실제로 조건부 세포 배지의 성장 인자가 세포 증식을 향상시킬 수 있기 때문에 더 빠른 세포 성장으로 이어질 수 있습니다. 그러나 모든 세포 매체를 교환하지는 아니하여 배양 오염의 위험이 증가하므로 갓 배양 된 세포의 첫 번째 구절 중에만 수행해야합니다. 세포를 세는 것은 올바른 밀도에서 ...

종양 관련 대식세포(TAM) 및 만성 염증, 암 발병 및 종양 발달에서의 그들의 역할은 최근 연구1,2에서중요한 표적이다. 발달 종양의 조직 미세 환경에 모집되는 말초 혈액 단핵구는 대식세포로 분화되고 대식세포3의2개의 주요 특수형으로 편광될 수 있다. 고전적으로 활성화된 대식세포는 주로 프로염증성 M1유사 표현형을 나타내며 대안적으로 활성화된 M2와 같은 아형은 주로 항염증 특성4를나타낸다. 대식세포는 세포 대사에 따라 이 두 가지 주요 표현형 사이에 동적으로 전환할 수 있으며, 중간 아류형은 염증 및 항염증 특성5를모두 갖는다. TAM은 두 표현형의 이기종 집단을 나타낸다. 암의 다른 모형에 있는 종양 촉진 기능 및 가난한 예후는, 그러나, 특히 M2 같이 대식세포6,7,8와연관됩니다.
대식세포의 기능적 프로파일과 종양 미세 환경 내의 다른 세포와의 상호 작용은 지속적인 종양 발달 중에 지속적으로 변화하는 환경에서 포착하기가 복잡하고 어렵습니다. 세포주는 정된 세포 간 기계장치를 보여주는 과정을 용이하게 할 수 있는 배양에서 안정한 생존성을 가진 동질적인 세포 인구를 제공할 수 있습니다. 단핵구와 같은 THP-1 세포주는 1차 인간 단핵구9에대한 합법적인 모델 시스템이다. 이 자발적으로 불멸한 세포주급성 단세포 백혈병을 가진 1세 유아의 말초 혈액으로부터9,10을얻었다. THP-1 세포의 분화 및 편광은 여러 연구에의해 보고되었으며11,12,13,14의여러 가지 방법으로 수행되었다. 따라서, M1과 같은 표현형으로 대식세포의 편광은 보상항염증리바운드 메커니즘을 선행하여 인터류킨 6(IL-6) 또는 이타코네이트15,16과같은 염증성 대식세포에 의해 생성된 사이토카인을 통해 M2와 같은 표현형을 촉진한다. 이것은 세포 활성화(17)다음 과다 촬영 염증 반응을 감쇠시키는 휴식 메커니즘으로 작용할 수 있다. 항염증M2와 같은 표현형으로 단세포및 THP-1 단세포와 같은 세포를 분화하고 편광하는 과정은 그 자체도 극복해야 하는 프로 염증 자극을 동반한다. 염증성 사이토카인 반응은 세포를 재공급하는 매체를 변경하거나, phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)와 같은 THP-1 세포를 분화하기 위해 화학 화합물을 첨가하고, 종양 괴사 인자 α(TNFα), 인터류킨 1β(IL-1β) 또는 IL-69에 의해 유발될 수 있다. PMA에 대한 응답으로 이러한 변경된 사이토카인 식 프로파일은 후속 대식세포편광(20)에영향을 미치고 예방할 수 있다. PMA 치료 후 전에 보고된 적절한 휴식 기간은 이러한 염증 반응을 감소시키고 세포 편광을 별개의 M2 와 같은표현형(21)으로용이하게 할 수 있도록 한다.
이 프로토콜은 14일 이내에 THP-1 단화세포와 같은 세포를 M2와 같은 표현형으로 분화하고 편광하는 방법을 보여 준다.

<table><tbody><tr><td>0.4% trypan blue</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>152-5061</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>USA Scientific, Ocala, USA</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 혈청학적 피펫</td><td>VWR, Radnor, USA&</td><td>nbsp; 89130-898</td><td></td></tr><tr><td>1000 &뮤; L TipOne 피펫 팁</td><td>USA Scientific, Ocala, USA</td><td>1111-2821</td><td></td></tr><tr><td>15 mL&nbsp; 원심분리기 튜브</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; L TipOne 피펫 팁</td><td>USA Scientific, Ocala, USA</td><td>1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L TipOne 피펫 팁</td><td>USA Scientific, Ocala, USA</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 혈청학 피펫</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>&nbsp; 89130-900</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 혈청학적 피펫</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>&nbsp; 89130-896</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>89039-662</td><td></td></tr><tr><td>Accutase 용액 500 mL</td><td>Sigma, St. Louis, USA</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>항생제 항진균 용액 (100x), 안정화</td><td>된 Sigma, St. Louis, USA</td><td>A5955-100 mL</td>, <td>10,000 단위 페니실린, 10 mg 스트렙토 마이신 및 25 μm; mg amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, 세포 배양에 적합</td></tr><tr><td>바인더 CO2 인큐베이터</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>C170-ULE3</td><td></td></tr><tr><td>CytoOne T-75cm 플라스크(필터 캡 포함</td>) <td>USA Scientific, Ocala, USA</td><td>CC7682-4875</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma, St. Louis, USA</td><td>D8537-500 mL</td><td>염화칼슘과 염화마그네슘이 없는 PBS는 대식세포 편광을 변화시킬 수 있으므로 사용해야 합니다</td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated)</td><td>Eppendorf, Enfield, USA</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올 (70%)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur flow cytometer</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA</td><td>-</td><td>유세포 분석기는 CellQuest 소프트웨어(BD Biosciences)</td></tr><tr><td>Falcon 24-well plate</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>ATCC, Manassas, USA</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse Anti-Human CD14</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA</td><td>555397</td><td>유세포 분석, 골수성 세포 마커(100회 테스트)</td></tr><tr><td>FITC Mouse Anti-Human CD80</td><td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td><td>557226</td><td>유세포 분석, M1 마커(100회 테스트)</td></tr><tr><td>FITC 마우스 IgG1 &kappa; Isotype Control</td><td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td><td>555748</td><td>유세포 분석, CD80에 대한 isotype control (100 tests)</td></tr><tr><td>FITC Mouse IgG2a, &kappa; Isotype Control</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA</td><td>553456</td><td>유세포 분석, CD14에 대한 isotype control (100 tests)</td></tr><tr><td>Human BD Fc block</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA</td><td>564220</td><td>유세포 분석, Fc block (0.25 mg)</td></tr><tr><td>Human interleukin 13 (IL-13)</td><td>R& D, 미국 미니애폴리스</td><td>IL-771-10 &mu; g</td><td></td></tr><tr><td>인간 인터루킨 4 (IL-4)</td><td>R& D, 미국 미니애폴리스</td><td>SRP3093-20 &mu; g</td><td></td></tr><tr><td>Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213)</td><td>Labconco, Kansas City, USA-L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>-글루타민 용액, 200 mM</td><td>ATCC, Manassas, USA</td><td>30-2214</td><td></td></tr><tr><td>대장균의 지질다당류(LPS) 0111:B4</td><td>Sigma, St. Louis, USA</td><td>L2630-100 mg</td><td></td></tr><tr><td>Mini Cell</td><td>Scrapers Biotium, Fremont, USA</td><td>22003</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 혈구계</td><td>Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>02-671-5</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse inverted microscope TS100</td><td>Nikon, Melville, USA-Nuclease-free</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>water</td><td>Invitrogen, Carlsbad, USA</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Light Microscope RH-2</td><td>Microscope Central, Feasterville, USA</td><td>40888</td><td></td></tr><tr><td>P10 variable pipet- Gilson</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>76180-014</td><td></td></tr><tr><td>P1000 가변 피펫-Gilson</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>76177-990</td><td></td></tr><tr><td>P200 가변 피펫- Gilson</td><td>VWR, Radnor, USA</td><td>76177-988</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human CD11b</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA</td><td>555388</td><td>유세포 분석, 골수성 세포 마커(100회 테스트)</td></tr><tr><td>PE 마우스 IgG1, &kappa; Isotype Control</td><td>BD Biosciences, San Diego, USA</td><td>555749</td><td>유세포 분석, CD11b에 대한 isotype control (100 테스트)</td></tr><tr><td>PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206</td><td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td><td>551136</td><td>유세포 분석, M2 마커 (100 테스트)</td></tr><tr><td>PE-Cy 5 Mouse IgG1 &kappa; Isotype Control</td><td>BD Pharmingen, San Diego, USA</td><td>555750</td><td>유세포 분석, CD206에 대한 isotype control (100 테스트)</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma, St. Louis, USA</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Powerpette Plus 피펫 VWR</td><td>, Radnor, USA</td><td>75856-448</td><td></td></tr><tr><td>Precision Water bath (model 183)</td><td>Precision Scientific, Chicago, USA</td><td>66551</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium</td><td>ATCC, Manassas, USA</td><td>30-2001</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>ATCC, Manassas, USA</td><td>TIB-202</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 단세포와 같은 thp-1 백혈병 세포선을 사용하여 m2와 같은 표현형으로 대식세포 분화 및 편광

Macrophage Differentiation and Polarization into an M2-Like Phenotype using a Human Monocyte-Like THP-1 Leukemia Cell Line

종양 관련 대식세포(TAM)는 외부 자극에 따라 발현 및 사이토카인 프로파일을 전환할 수 있다. 이 놀라운 가소성은 TAM이 종양 미세 환경 내의 지속적인 변화에 적응할 수 있게 합니다. 대식세포는 주로 프로 염증 (M1 같이) 또는 항 염증 (M2 같이) 속성을 가질 수 있으며 이 두 가지 주요 상태 간에 지속적으로 전환 할 수 있습니다. 종양 환경 내의 M2 와 같은 대식세포는 여러 유형의 암에서 암 진행 및 불량 예후와 관련이 있습니다. THP-1 세포의 분화 및 편광을 유도하기 위한 많은 다른 방법은 세포 간 세포 간 메커니즘및 종양의 미세 환경 내의 TAM의 효과를 조사하기 위해 사용됩니다. 현재, THP-1 세포주사용으로 M2유사 대식세포 편광에 대한 확립된 모델은 없으며, 특정 체외 자극으로 인한 대식세포의 발현 및 사이토카인 프로파일의 결과는 연구마다 차이가 있다. 이 프로토콜은 THP-1 단세포와 같은 세포를 M0 대식세포로 분화하고 14일 이내에 세포를 M2와 같은 표현형으로 더 편광하는 상세한 지침의 역할을 합니다. 우리는 빛 현미경 을 사용하여 THP-1 단화 와 같은 세포, 분화 된 대식세포 및 편광 M2 와 같은 대식세포의 형태학적 변화를 보여줍니다. 이 모델은 TAM의 항염증 효과와 종양 미세 환경의 다른 세포 집단과의 상호 작용을 조사하는 세포주 모델의 기초입니다.

M2와 같은 대식세포는 특징이 었으며, M2 편광은 차별화 마커(CD) CD14, CD11b, CD80(M1 형 마커) 및 CD206(M2 와 같은 마커)의 클러스터를 위한 유동 세포측정을 사용하여 검증되었다. 흐름 세포분석 염색은 제조업체의 지시에 따라 수행되었다. 대식세포는 PBS/5% FBS로 세척하고 특이하지 않은 결합을 피하기 위해 Fcγ 수용체 블록으로 배양되었습니다. 세포는 FITC-컨쥬게이드 마우스 항인간 CD14 및 CD80 항체, PE-컨쥬게이드 마우스 항인간 CD11b 항체, 그리고 PE-탠덤 컨쥬게이드 마우스 항인간 CD206 항체 및 이소타입 일치IgG(재료의 표)로염색하였다. 4색 유동 세포측정 해석 및 형광 수량이 수행되었다. 세포의 게이팅은 전방 산란 및 측면 산란에 따른 세포 파편을 제외하고 수행되었다.
단세포 및 대식세포 마커 CD14 및 CD11b는 각각 세포의 70.9%와 74.7%로<strong class="x...

M2 와 같은 종양 관련 대식세포 (TAM)는 암에서 종양 진행 및 가난한 예후와 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 THP-1 단핵세포와 같은 세포를 14일 이내에 M2와 같은 대식세포로 재현가능하게 분화하고 편광하는 상세한 가이드의 역할을 합니다. 이 모델은 종양 미세 환경 내에서 TAM의 항염증 효과를 조사하는 기초가 된다.

인간 단세포와 같은 THP-1 백혈병 세포선을 사용하여 M2와 같은 표현형으로 대식세포 분화 및 편광

Tumor-associated macrophages (TAM) can switch their expression and cytokine profile according to external stimuli. This remarkable plasticity enables TAM ...

항 염증 종양 관련 대식세포는 암에서 진행 및 가난한 예후와 연결됩니다. 이 프로토콜은 14 일 이내에 THP-1 단화 세포를 M2와 같은 대식세포로 분화하고 편광하는 가이드입니다. 현재 항염증성 THP-1 편광에 대한 확립된 모델은 없다.이 프로토콜은 적절한 휴식 기간과 장기간편광 프로세스를 사용하여 고유한 M2와 같은 대식세포 하위 유형을 만듭니다. 종양 발달은 예를 들어, 결장암 및 조직 리모델링에서 항염증성 대식세포에 의해 조절된다. 그들의 기능을 조사하는 연구 중, 뚜렷한 M2 와 같은 하위 타입의 표준화된 창조는 재현 가능한 사실 인정을 보장합니다.타이머를 150초 동안 설정하여 시작합니다. 액체 질소에서 THP-1 세포줄을 함유 한 냉동 유리병을 제거하고 깨끗한 수조에서 섭씨 37도에서 즉시 유리병을 해동하고 유리병이 수조에 투입되는 즉시 타이머를 시작합니다. 해동 공정으로 인해 축적된 압력을 방출하기 위해 캡을 풀어 튜브 개구부가 오염을 피하기 위해 물에 닿지 않도록 합니다.얼음 칩의 크기가 약 4밀리미터가 유리병 내에 남을 때까지 세포 서스펜션을 해동하고 즉시 다음 단계로 진행합니다. 세포 현탁액의 액체 상을 따뜻한 성장 매체의 9밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 옮는다. 그런 다음 이 따뜻한 중간 세포 현탁액의 1밀리리터를 THP-1 유리병으로 옮기고 15 밀리리터 튜브로 돌려전달하여 남은 얼음 칩을 녹이고 유리병을 플러시하여 세포가 남지 않도록 합니다.서스펜션을 1밀리리터 파이펫으로 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞습니다. 샘플의 약 10 마이크로리터를 제거하여 trypan blue를 사용하여 생존가능성을 위해 세포를 계산합니다. 명확한 세포질이 있는 세포는 실행 가능하고, 청색 세포질은 세포사를 나타냅니다.계산하는 동안 따뜻한 셀 서스펜션을 섭씨 37도에서 7분 동안 200회 G로 회전합니다. 상체를 완전히 제거하고 밀리리터당 500, 000 세포의 세포 밀도를 달성하기 위해 성장 배지에서 세포를 재연한다. 서스펜션을 부드럽게 혼합하고 22 밀리리터를 T75 세포 배양 플라스크로 옮킨다.플라스크를 37°C의 인큐베이터에 똑바로 세워 5%의 이산화탄소 농도를 저장하고 3~4일마다 성장 매체를 교환합니다. 세포 현탁액을 잘 24웰 세포 배양판으로 밀리리터당 300, 000의 밀도로 세포를 시드하도록 준비한다. 배지를 부드럽게 섞고 26밀리리터를 50밀리리터 튜브에 준비합니다.세포 함유 배지의 1밀리리터를 24웰 플레이트의 각 웰로 옮킨다. 전송 사이에 위아래로 파이프를 하여 미디어를 부드럽게 섞습니다. 새로 준비된 PMA 작업 용액을 얼음 위에 보관하고 100나노그램의 PMA를 잘 추가합니다.72 시간 동안 추가 치료없이 인큐베이터에서 플레이트를 배양하십시오. 72 시간 후, 성장 매체를 제거하고 파이펫 팁과 우물의 바닥을 만지지 않도록, 신선한 성장 매체의 1 밀리리터로 교체. 세포가 인큐베이터에서 또 다른 96 시간 동안 쉬게하십시오.성장 매체를 제거하고 신선한 성장 매체의 1 밀리리터로 대체하십시오. 인터류빈 4와 20 나노그램의 인터류키(interleukin) 13그램을 잘 넣습니다. 그런 다음 세포가 인큐베이터에서 48 시간 동안 쉬게하십시오.48 시간 후에 전체 과정을 반복하고 세포가 인큐베이터에서 또 다른 48 시간 동안 쉬게하십시오. 성장 매체를 제거하고 신선한 성장 매체의 1 밀리리터로 대체하십시오. 그런 다음 세포가 인큐베이터에서 48 시간 동안 쉬게하십시오.각 우물에서 따뜻한 세포 매체를 제거하고 칼슘과 마그네슘과 5 % FBS없이 얼음 차가운 PBS의 1 밀리리터 혼합물로 대체합니다. 그런 다음 즉시 45 분 동안 얼음에 세포 판을 놓습니다. 얼음에 45 분 후, 미니 셀 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁어.분리된 대식세포는 차가운 PBS로 부드럽게 옮기고 얼음 위에 보관된 15밀리리터 튜브에서 5%FBS를 부드럽게 전달합니다. 편광 방법에서 유래된 대식세포는 CD14의 발현뿐만 아니라 CD11b 마커를 보여 준다. 단세포 및 대식세포 마커 CD14 및 CD11b는 각각 70.9%와 74.7%의 세포로 발현되었다.세포는 세포의 0.2%에서 M1 과 같은 마커 CD80의 낮은 표면 수준을 보였고, 세포의 62.6%에서 M2와 같은 마커 CD206의 높은 표면 수준을 보였다. 중간 크기의 THP-1 세포가 바이알의 바닥으로 가라앉는 경향이 있고 기계적 스트레스를 통해 활성화하기 쉽기 때문에, 세포의 부드러운 혼합 및 취급이 중요하다. M2와 같은 대식세포는 재현적으로 생성되며 QR-TPCR, ELISA 및 유동 세포측정을 사용하여 특징지어지고 있습니다.이것은 암 발달 또는 조직 리모델링에 있는 항염증제 기계장치를 조사하기 위한 기초입니다.

macrophage-differentiation-polarization-into-an-m2-like-phenotype

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 말초 혈액 유래 단핵구를 M1 또는 M2 대식세포로 분화 및 분극을 유도하는 절차를 보여줍니다. 과립구-대식세포 집락자극인자, 지질다당류, 인터페론-감마를 이용한 배양은 전염증성 M1 대식세포를 생성하고, 대식세포 집락자극인자와 인터루킨-4를 사용한 배양은 항염증성 M2 대식세포 생산을 유도합니다.

Differentiation and Polarization of Monocyte-Derived Cells into Macrophage-Like Cells

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 시스템의 중요한 세포입니다. 여기, 우리는 사용하기 쉬운...

<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

우리는 인간 대 식세포의 세대를위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시한다. 버피 코트는 이중 밀도 구배 원심 분리에 의해 처리되고 격리 된 단핵구는 테프론 코팅 된 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화된다. 이 대 식세포의 수율을 극대화하고 다음 실험을 위해 세포 수확을 용이하게한다.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 분화된 인간 단핵구 유래 대식세포의 세포 배양을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 프로토콜은 대식세포로의 벌크 분화와 결합된 단핵구의 동결 보존을 활용합니다. 그런 다음 수확된 대식세포를 실험 수행에 필요한 세포 밀도의 배양 웰에 파종할 수 있습니다.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

우리는 인간의 세포의 proteomic 서명을 macrophage 분극에 낮은 산소 환경 영향의 결정에이 적용 하는 프로토콜을 제시.

낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석

본 프로토콜은 MFP 라벨이 부착된 악성 균주 H37Rv에 감염된 대식세포와 말초 혈액 단혈세포의 분화에 기초하여 인간 M1 또는 M2 편광 대식세포에서 진코박테리움 결핵 감염을 연구하고, M1의 마커를 포함한 10색 마커를 사용하여 유동 세포암법으로 분석하는 방법을 제공한다.

M1 및 M2 인간 단세포 유래 세포의 편광 및 진균 결핵 감염에 대한 유동 세포측정을 분석

여기에서는 현재 프로토콜의 신뢰성과 재현성을 개선하고 추가 연구를 촉진하는 것을 목표로 in vitro 임플란트 표면의 면역 조절 가능성을 평가하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 분비 사이토카인 프로파일, mRNA 발현 및 세포 표면 마커는 혈액 단핵구 유래 대식세포를 사용하여 모니터링하여 티타늄에서 배양된 대식세포 분극을 조사했습니다.

임플란트 표면의 M1 및 M2 인간 단핵구 유래 대식세포의 분극 및 특성화 

단핵구와 대식세포는 건강과 질병에 중요한 매우 가소성 및 재프로그래밍 가능한 면역 세포입니다. 그들은 특정 분화 프로그램과 표현형을 채택하여 광범위한 자극을 감지하고 반응합니다. 당사는 대식세포 분극 및 재프로그래밍을 연구하기 위해 in-vitro 모델을 표준화하여 연구를 위한 유용한 도구를 제공합니다.

In-vitro assay를 위한 human monocyte-derived Macrophage의 재프로그래밍 모델

당사는 기존 단핵구-단층 분석법(MMA)에 대한 개선 사항을 개발하고 방법을 업데이트했으며, 이 분석에서는 대식세포를 사용하여 수혈 의학 및 면역학에서 적혈구 동종 항체의 임상적 관련성을 더 잘 예측하는 데 도움을 줍니다. 이 분석법은 단핵구-대식세포 분석법(M-MA)이라고 합니다.

Monocyte-Macrophage Assay를 이용한 적혈구 항체 유의성 예측(Prediction of Red Blood Cell Antibody Significance Using the Monocyte-Macrophage Assay)

배우세요 THP-1 세포를 M2 대식세포로 14일 내 분화 및 편극하는 방법을. 이 프로토콜은 종양 미세환경에서 항염증성 거대식세포 기능을 연구하는 재현 가능한 모델을 제공합니다.

인간 단세포와 같은 THP-1 백혈병 세포선을 사용하여 M2와 같은 표현형으로 대식세포 분화 및 편광

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