Name: 乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学ぶ乳がん研究における乳腺上皮細胞と内皮細胞の相互作用を3Dスフェロイドモデルで解析する方法。がん細胞の増殖と転移の分子メカニズムを解明し、治療戦略の開発に貢献する信頼性の高いインビトロ系を構築します。

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この研究は、がん研究財団/スイス癌連盟がRKDと国立衛生研究所のEKJ助成金DK079307にKFS-4125-02-2017を付与することによって支援されました。

1. 細胞培養
注:無菌条件下での細胞処理を行います。
<ol><li>ヒトアンビリカル静脈内皮細胞(HUVEC)サブカルチャー<ol>
<li>75cm2 フラスコにコラーゲン(5μg/cm2)(ラットテール)を室温(RT)または37°Cで2〜3時間、水で洗い流し、フラスコを乾燥させます。</li>
		<li>成長培地でHUVECを成長させる (EBM-2, 内皮基底培地-2) グルタミン (1x = 2 mM), 抗生物質抗ミキ酸溶液 (AA; ストレプトマイシン100 μg/mL、ペニシリン100 μg/mL、アンホテリシンBの0.025 μg/mL、LSGS(2%v/v FCS、ヒドロコルチゾン1 μg/mL、ヒト表皮成長因子10ng/mL、 10 μg/mLのヘパリン)および10%FCS(胎児子牛血清)を標準的な組織培養条件下(37°C、5%CO2)下で実施した。細胞が70%-80%の合流に達するまで、2日ごとに培地を交換してください。</li>
		<li>5 mLのHBSS(Ca2+ およびMg2+なし)でサブコンフルエント培養物を洗浄し、3 mLのトリプシン(0.25%をHBSSで希釈(Ca2+ およびMg2+なし)を加える) メモ:HBSSはPBSに置き換えることもできます。</li>
		<li>37°Cで2分間培養し(微視的に細胞が切り離され、切り上げられたかどうかを顕微鏡的に確認する)、FCS培地(DMEM-F12またはEBM-2、10%FCS)の6 mLを加えて剥離反応を停止します。</li>
		<li>細胞懸濁液を250xgでRTで5分間遠心し、上清を捨てる。</li>
		<li>増殖培地中の細胞を中断し、75cm2フラスコまたは培養皿に種子を入れ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ミシガンがん財団-7(MCF-7、ヒト乳腺癌細胞)サブカルチャー<ol>
<li>成長培地で75cm2フラスコでヒト乳癌細胞株を成長させる(DMEM/F12培地は、市販のグルタミン(1x)を添加し、抗生物質抗抗薬溶液(AA; ストレプトマイシン100μg/mL、ペニシリン100μg/mL、amphotericin Bの0.025 μg/mL、標準的な組織培養条件下でのFCS 10%(37°C、5%CO2)2~3日ごとに培地を変更します。</li>
		<li>HBSSの5 mL(Ca 2+およびMg2+なし)でサブコンフルエント細胞培養物(70%-80%合流)を洗浄し、3 mLのトリプシン(0.5%はHBSSで希釈)を37°Cで37°C(顕微鏡的に細胞が切り離されていることを確認)を加えます。 メモ:HBSSはPBSに置き換えることもできます。</li>
		<li>8 mLのFCS培地を加えて剥離反応を停止し、遠心分離機を250 x g で5分間RTで5分間加え、上清を捨てます。</li>
		<li>75 cm2 フラスコまたは培養皿に成長培地とプレートにペレットを懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. スフェロイド形成
<ol><li>プレート5 x 105 細胞/mL(HUVECおよびMCF-7)を3.5cmの丸い皿に入れ、48時間培養する。</li>
	<li>メッキされた細胞を24時間または所望に応じて処置またはトランスフェクトする。</li>
	<li>96ウェルU-底板で行う任意のステップ:1 mLのHBSS(Ca2+ およびMg2+)で細胞を洗浄し、青色の染料(0.5 μg/mL)およびMCF-7細胞を使用して、緑色の色素(0.5 μM)を使用してHUVECを染色し、それぞれ37°Cおよび5%COCO に30m-m0m300m300m00の間に入れる。</li>
	<li>1 mLのHBSS(Ca2+ およびMg2+なし)で細胞を洗浄し、P1000ピペットを使用して各ラウンド皿に酵素剥離試薬1 mL(HUVECの場合は0.25%トリプシン、MCF-7の場合は0.5%トリプシン)を加え、細胞が取り外されるまで2〜5分間インキュベートします。</li>
	<li>各細胞タイプを5 mLラウンドボトムポリスチレンチューブに別々に集め、P1000ピペットを使用して1mLのFCS培地を1mL加えて酵素反応を止めます。細胞懸濁液を250xgで5分間遠心分離する。</li>
	<li>慎重に上清を吸引し、ステロイドフリー培地(EBM-2、グルタミン、抗生物質抗抗薬、0.4%FCS sf(炭剥ぎ取り)の1mLで細胞を懸濁させる。 注: ステロイドフリーの媒体は、通常の成長培地に置き換えることができます。.</li>
	<li>希釈した各細胞懸濁液100μLを希釈し、全細胞数を決定し、治療媒体(EBM-2、グルタミン、抗生物質抗ミヒコティック、0.4%FCS sf、車両/治療)を計算して、細胞毎に5 x 103細胞/mLまたは3.4x10細胞/50細胞の細胞懸濁液を得るために必要な量を計算します。<ol>
<li>セル数<ol>
<li>セルカウンターバイアルでDiluent II溶液を使用して 、機能 ボタンと スタート ボタン(セットアップS3)を押して、マシンとフラッシュをオンにします。</li>
			<li>S4をセットアップし、 開始 を押して、新鮮な希釈II溶液でブランクを測定します。</li>
			<li>希釈II溶液の10 mLで細胞懸濁液の100 μLでシンチレーションバイアルを変更し、サンプルを測定する:セットアップS4と スタートを押す。</li>
			<li>デジタルディスプレイの mL あたりのセル数を確認します。 注:セルカウントは、他の手動または自動システムを使用して行うことができます:ヘモサイトメーターのグリッドライン、光散乱セルカウント技術、電気インピーダンス、細胞染色を使用したイメージングベースのシステム、例えば、トリパンブルー。</li>
		</ol>
</li>
		<li>96ウェルU-底板<ol>
<li>各細胞懸濁液(5 x 103 細胞/mL)の5mLを調製し、それらを混合して1:1の比率で10mLの最終体積を得る。</li>
			<li>手動繰り返しピペットを使用して、96ウェルUボトムプレートの各ウェルに100 μLのセルサスペンションをピペットアウトします。</li>
			<li>プレートを標準的な組織培養条件下でインキュベーターに入れ、48時間後にスフェロイドの形成を確認します。</li>
			<li>任意のステップ:蛍光ステレオ顕微鏡を使用して、スフェロイド(40x)の写真を撮ります。 注:この方法は、48時間後に96個のスフェロイド(1つのスフェロイド/ウェル)を生成し、通常は成長研究に使用されます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ハンギングドロップ<ol>
<li>細胞懸濁液(3.4 x 105 細胞/mL)を1:1の比率で混合し、2mLの最終体積を得る。</li>
			<li>P20ピペットを使用して、10cmペトリ皿の逆蓋に15μL滴の形で細胞混合物を播種します。</li>
			<li>蓋を滴で反転させ、皿の底部に5mLのベース培地(EBM-2)を加えて、滴の蒸発を避けます。 注: この方法は、48 時間後に 1 つの回転楕円体/ドロップを生成します。蓋を切り替えながら、ドロップがマージされないように、ドロップが互いに十分に離れていることを確認します。必要に応じて10cmペトリ皿を1つ以上使用してください。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. スフェロイド成長研究
<ol><li>96ウェルU底板にHUVECとMCF-7細胞混合物(5 x 102 細胞/ウェル)のプレート100 μLをプレートし、インキュベーターに入れます。</li>
	<li>めっき後48時間、反転顕微鏡(ブライトフィールド)でスフェロイド形成を確認します。96時間の文化で写真(治療ごとに少なくとも6枚、40倍)を撮る。</li>
	<li>画像処理ソフトウェアを使用して画像を開き、画像を300ピクセル/インチに処理し、画像をtiffファイルとして保存します。</li>
	<li>ImageJ ソフトウェアをダウンロードして開きます。[ ファイル ] オプションをクリックし、[ 開く] に進みます。</li>
	<li>バイナリ イメージ (黒と白) を持つには、対象領域を黒の飽和領域に統一して変換します。この場合は、[ イメージ ] オプションを選択 し、[8 ビット|タイプ] を選択します。今、画像は白黒です。</li>
	<li>フリーハンド選択ツールを使用して、回転楕円体の境界線を描画します。</li>
	<li>対象領域を計算し、オブジェクトまたは前景ピクセルを背景ピクセルから分離するには、しきい値機能を使用します。 </li>
	<li>これで、しきい値ポップアップウィンドウが開きます。上のバーは最小しきい値を示します: 値をゼロに設定します。下のバーは最大しきい値を示します:対象領域が完全に赤くなるまでバーを移動します。 注: 色が赤でない場合は、[しきい値] ウィンドウから [ 赤 ] を選択します。</li>
	<li>分析|に移動[計測値] を設定し、[面積] と [周長] を選択します。</li>
	<li>対象領域を測定するには、[ 解析] オプションを選択し、[ パーティクルを解析 ]ツールを使用します。[ パーティクルの解析 ] ウィンドウで、[ 計測するサイズ] (0.00003-無限大または 3-無限大)を設定し、[結果を 集計 および 表示] を選択します。次に 、[OK] をクリックします。</li>
	<li>結果はチャートに表示されます。測定値をスプレッドシートにコピーしてデータを分析します。 注: 領域は合計ピクセル数として計算されます。計算には[合計面積]を使用します。</li>
</ol>4. スフェロイド免疫組織化学研究
<ol><li>サンプル準備<ol>
<li>HUVEC成長培地で96ウェルU-底板にHUVECとMCF-7(5 x 103 細胞/ウェル)の細胞混合物を96時間プレートに入れます。</li>
		<li>P200 μL ピペットのカットチップを使用して、約 50 個のスフェロイドを 1.5 mL チューブに集める。重力でチューブの底に落ち着き、上清を捨てます。</li>
		<li>スフェロイドを4%PFAの500 μLで1時間、RTで固定します。</li>
		<li>熱板を用いた熱板を3~5分間熱いプレートでPBSで沸騰させ、アガロース粉末を完全に溶解し、60°C程度まで冷却します。</li>
		<li>P1000ピペットでPFAを取り出し、500 μLのPBSでスフェロイドを洗浄し、堆積液を使用します。上清を捨てます。</li>
		<li>慎重に600 μLのアガロース溶液をスフェロイドを含む1.5 mLチューブに入れ、水平ローターを177 x g の遠心分離機に2分間置きます。</li>
		<li>アガロース溶液の途中に短い文字列を追加して、チューブからプラグを簡単に取り外します。</li>
		<li>氷上または4°Cでアガロースプラグを固めます。 ペレットの乾燥を避けるために、PBSを500 μLのチューブに加えます。 注:サンプルは、その後の脱水、パラフィン埋め込み、切り離し、顕微鏡スライドへの転送、およびIHC染色(ソフィストラボによって行われる)の準備ができています。</li>
	</ol></li>
	<li>画像の取得と処理<ol>
<li>体型顕微鏡を用いて、スフェロイド切片の画像を取得します。</li>
		<li>各サンプルの 3 つのイメージを.jpgファイルとして保存します。</li>
		<li>ImageJ ソフトウェアを開きます。JPEG 画像を開き、[ ファイル ] をクリックし、[ 開く] をクリックします。</li>
		<li>[イメージ]オプションで[色と色のデコンボリューション]を選択します。</li>
		<li>カラーデコンボルション 1.7 ウィンドウで H DAB ベクトルを選択すると、3 つの画像が表示されます。 注: カラー 1 はヘマトキシリン染色(青/紫)のみを表し、カラー 2 は DAB 染色(茶色)のみを表します。 カラー 3 は、2 つの染色で画像解析に必要ありません。</li>
		<li>[色 1]ウィンドウを選択し、[しきい値] を設定します|。調整して[しきい値]をクリックします。[しきい値]ウィンドウが表示されます。</li>
		<li>最小しきい値をゼロに設定したまま、最大しきい値を調整して、真のシグナルに影響を与えることなくバックグラウンド信号を削除します。[ 適用] をクリックします。<ol>
<li>面積測定<ol>
<li>[ 分析] をクリックし、[ 測定の設定] を選択します。[ 面積]、[平均グレー値]、[最小]および[ 最大グレー]の値 を選択し 、[OK]を クリックして確定します。</li>
				<li>[解析] オプションを使用して核のサイズを測定し、[測定]を選択します。 注: 結果 ウィンドウには、画像の名前(ラベル)、画像のサイズ(面積)、IHC画像の平均ピクセル強度(平均)、および最小および最大グレー値(最小、最大)が表示されます。計算には平均値を使用します。</li>
				<li>「カラー 2」(および、二重染色がある場合はカラー 3)ウィンドウに対して、手順 4.2.6 ~4.7.1.2 を繰り返します。</li>
			</ol>
</li>
			<li>細胞定量<ol>
<li>[ 処理] をクリックし、 オプション [バイナリ] を選択し、[ 集水域 ] を選択してセルを分離します。</li>
				<li>[解析]に移動し、[パーティクルの解析] をクリックします。[パーティクルを解析]ポップアップ ウィンドウで、特定でないパーティクルを除外するセルのサイズを設定します。次に、[表示] オプションのドロップダウン ボックスをクリックし、[アウトライン] を選択します。次に、[OK] をクリックします。</li>
				<li>「カラー 2」(および、二重染色がある場合はColor 3)ウィンドウに対して、ステップ 4.2.6~4.2.7 とセル定量手順(セクション 4.2.7.2)を繰り返します。 注: 次の 3 つのウィンドウが表示されます: 1) 要約結果 (セル数、合計面積、平均サイズ、面積と平均の割合)、2) 結果 (カウントされるセルに対応) および 3) 図面ウィンドウ (カウントされるセルの画像を示しています)。</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>5. スフェロイドの生きた/死んだ染色
<ol><li>DMSOでカルセインAMの4 mMストック溶液(染色は緑色の細胞を生きる)と2mMのエチジウムホモジマーをDMSOで調製(死細胞赤を染色する)1.5 mLチューブで。</li>
	<li>EBM-2で1:50希釈したカルセインAMとエチジウムホモジマーの混合物の10 μL/wellを加えるために必要な溶液の量を計算します。</li>
	<li>染色混合物をスフェロイドに加え、30〜60分間の標準的な組織培養条件下でインキュベーターにプレートを置きます。</li>
	<li>蛍光ステレオ顕微鏡を用いて画像(40x)を取得します。</li>
</ol>6. スフェロイドのタンパク質とRNAの分離
<ol><li>細胞タイプあたり3.4 x 105細胞 /mLで細胞懸濁液を調製し、1:1の比率で混合し、10cmペトリ皿の蓋に15μL滴の形でP20ピペットを使用して細胞混合物を播種します。蓋を反転し、96時間の標準的な組織培養条件下でインキュベーターに入れます。</li>
	<li>5 mL滅菌ポリスチレンピペットを使用して、15 mL ラウンドボトムポリスチレンチューブにスフェロイドを集めるには、PBS の 5~6 mL を使用してください。 注:15 mL円錐形チューブを使用することも可能です。</li>
	<li>250xgでスメロイド懸濁液を5分間遠心し、上清を慎重に吸引する。</li>
	<li>500 μL のトリプシン(100%)を加え、P1000 ピペットを使用して上下にピペットを 30 sで分解してスフェロイドを分解し、細胞懸濁液を達成します。</li>
	<li>10%FCS培地でトリプシンを中和し、チューブを250xgで5分間遠心し、上清を吸引する。</li>
	<li>メーカーのプロトコル(DNAフリーRNA分離用の特定のキット)に従って、300 μLのRNAリシスバッファーを使用して細胞ペレットをリセリングします。 注:リシスバッファーは、RNAを抽出するために、無傷のスフェロイド(トリプシンステップは必要ありません)に直接追加することもできます。ペレット化されたスフェロイドに300μLのリシスバッファーを加え、氷にチューブを入れ、P200ピペットを使用して10回トリチュレートします。続いて、上記のようにRNAを単離する。マトリックス干渉によるRNA回収が低い場合は、スフェロイド解離が必要になることがあります。</li>
	<li>あるいは、タンパク質の分離のためにLysisバッファーの70 μLを使用します。超音波処理により2-4 sの均質化し、BCAアッセイキットを使用してメーカーのプロトコルに従ってタンパク質濃度を決定します。 注:タンパク質の分離のために、ペレット化されたスフェロイドは、超音波処理に続いて、リシスバッファーで直接にlysedすることができます。全タンパク質25 μgを使用して、ウェスタンブロットを実行します。</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

2D細胞培養と比較して、革新的な3Dスフェロイド培養技術は、臓器の微小環境、細胞間相互作用、およびイン ビトロでの薬物応答を再構築するためのより優れた強力なツールである。これは、乳がん研究のための多細胞(上皮および内皮)細胞株からのスフェロイドの形成を記述する最初のプロトコルである。このプロトコルは、最大5日間のスフェロイドの回転楕円体3D成長を保証し、スパフィン埋め込み、切除、および組織学的染色後にスフェロイドを検査することができます。興味深いことに、スフェロイド内の細胞要素は、細胞増殖を促進し、増殖およびアポトーシス刺激に応答する受容体を依然として発現する。記載されたプロトコルは、タンパク質またはRNA/DNA分析に十分な生物学的材料を生成する。上記の共培養システムは、実験室の状態で容易に低コストで達成され、将来の適用、特に乳癌治療および薬物感受性検査において有利となり得る。さらに、このプロトコルは、異なる上皮および内皮細胞タイプに適用することができる。
生体内に存在する複雑な組織をインビトロで模倣することは非常に困難です。...

実験のための動物の使用には限界があります。動物実験はヒトの疾患進行を正確に模倣することはできず、動物とヒトは病原体に対して同一の反応を示さない。さらに、動物の苦しみや倫理的問題に対する懸念による動物実験の制限1,2 研究プログラムをますます制約する。 In vitro 動物の使用を回避するためにシステムが広く開発されています。さらに、ヒト細胞の使用は、 in vitro 病態生理学的および治療的調査に関連するモデル。従来の単層(2D)細胞培養は、ある程度ヒト組織を模倣するため広く使用されている。しかし、2D単一培養は人間の器官を模倣することができず、2D単一培養は元の器官の複雑な微小環境を模倣し、模倣する in vivo 状況3,4,5,6.さらに、単層細胞培養では、薬物治療は容易にすべての細胞を破壊/損傷する可能性があります。重要なことに、これらの制限のいくつかは、多層三次元(3D)細胞培養に切り替えることによって克服することができる7,8.実際、3D培養モデルは、細胞の構造、レイアウト、および主要組織における細胞の機能をよりよく反映することが示されています。これらの3D培養は、機能的器官と同様に、様々な細胞株を用いて形成することができる。確かに、3D文化の2つのモデルがあります。1つのモデルは、クラスターを形成し、それらを球体(足場のないモデル)に再編成する集約された細胞の回転楕円体を生成します。第二は、より複雑な構造を有し、器官のミニチュア版と考えられている多臓器特異的細胞の組み合わせで構成されるオルガノイドを生み出す9,10.このため、3D培養システムは、多くの生物学的および臨床的用途を備えた革新的な技術を表しています。したがって、スフェロイドおよびオルガノイドは、再生医療、薬物スクリーニング、および毒物学的研究に関連する疾患モデリングおよび研究に多くの用途を有する6,11,12,13,14,15.3D技術から派生した発がん性スフェロイドは、関連する細胞タイプの形態と表現型を再現し、 in vivo 腫瘍の微小環境、および腫瘍の発達中に作動する細胞通信およびシグナル伝達経路をモデル化する16,17,18.さらに、がん生物学の理解を改善するために、腫瘍スフェロイド/オルガノイドは、潜在的な患者特異的な抗癌療法(個別化)を特定し、その有効性、毒性、および長期的な影響を評価するためにも使用できます。19,20,21,22.球体は、細胞および三次元組織アーキテクチャを維持する能力、模倣する能力のために病態生理学、疾患モデリングおよび薬物スクリーニングを調査する顕著な機会を開いた in vivo 状況、および細胞と細胞の相互作用。しかし、血管/全身性成分の欠如、機能性免疫または神経系などのこのシステムの限界を認識する必要があり、システムは動物モデルと比較して還元主義者のアプローチを表します。実際、動物モデルとは対照的に、3D構造は人体内の生物学の近似のみを提供します。3D法の限界を理解することは、研究者がより大きなスケールで臓器をよりよく表すスフェロイドを生成するためのより洗練された有効なプロセスを設計するのに役立つかもしれません23,24,25.
癌は世界的に主要な死因であり、乳癌は女性26、27、28の中で最も一般的な癌である。乳癌の複雑な微小環境を模倣するために、乳癌スフェロイドは、乳房腫瘍、すなわち上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および/または免疫細胞において顕著な役割を果たす細胞を用いて培養されるべきである。また、乳がんを表すスフェロイドについては、女性ホルモン受容体(エストロゲン/プロゲステロン受容体)の発現、患者腫瘍組織学的状態を保存する能力、および治療に対する応答を模倣する能力も考慮すべきである。研究は、3D共培養系が生体内の一次組織と同様の細胞組織を有し、刺激にリアルタイムで反応する能力を有し、機能的アンドロゲン受容体29、30、31、32を有することを示している。したがって、同様のアプローチは、インビトロで乳房腫瘍を模倣するのに役立つ可能性があります。現在のプロトコルの目的は、乳癌スフェロイドを生成する新しい方法を確立することです。この方法は、エストロゲン受容体陽性MCF-7細胞(上皮細胞の不滅のヒト細胞株)および血管内皮細胞(HUVEC)またはリンパ系内皮細胞(HMVEC-DNeo)を利用して、腫瘍内でこれらの細胞間の相互作用を模倣または密接に反映するモデルを作成する。MCF-7(エストロゲン応答性)および内皮細胞は、本研究においてスフェロイドの開発に用いられてきたが、胸腫瘍質量の約80%を占める線維芽細胞のような他の細胞も、将来的に組み合わせて乳房腫瘍をよりよく発現し、模倣することができる。
例えば、回転楕円体を形成するいくつかの方法があります: 1) 重力33,34を採用する吊り下げ液滴法。2)外部磁石35に曝露された磁気ナノ粒子を用いる磁気浮上法、及び3)低付着プレート36、37に細胞を播種して行うスフェロイドマイクロプレート法。1つの細胞タイプのみを使用する既存の方法に基づいて、本プロトコルは、生体内38、39、40、41における乳癌腫瘍の増殖条件をよりよく模倣するために上皮細胞および内皮細胞を用いて最適化されている。この方法は、低コストで、最小限の機器要件で実験室で簡単に達成することができます。ラボの必要性/目標に基づいて、異なるアプローチがスフェロイドを形成し、これらのスフェロイドから関連する細胞材料を得るために使用されました。この文脈では、DNA、RNA、またはタンパク質解析のために、3Dスフェロイドは、吊り下げドロップ法と内皮細胞と上皮細胞を共培養することによって産生される。しかし、機能研究のために、例えば、短い干渉(siRNA)トランスフェクションおよび/またはホルモン処理後の細胞増殖を監視するために、スフェロイドはU-底板を用いて生成される。
この技術プロトコルの目的は、1)乳癌多細胞型スフェロイドを形成するための詳細なステップバイステップの説明を提供することです, 2) 組織染色のためのサンプルを調製, および 3) RNA, DNA, タンパク質の抽出のための細胞のコレクション.安価な吊り下げ方法と、より高価なU-底板の両方が、スフェロイドを形成するために使用されます。ここでは、細胞増殖、アポトーシス、および上皮細胞および内皮細胞の分布をスフェロイド内で評価するマーカーによる切除とその後の免疫染色のためのスフェロイドを調製(固定)するためのプロトコルが提供される。さらに、このプロトコルは ImageJ ソフトウェアを使用して、組織学的データの完全な段階ごとの分析を示しています。生物学的データの解釈は、実験の種類や使用する抗体によって異なります。固定スフェロイドの切除とセクションのその後の染色は、ルーチン病理実験室(ソフィストラボ:info@sophistolab.ch)

<table><tbody><tr><td>100 mm &times; 20 mm 組織培養処理培養ディッシュ</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>149MULTI0C1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Tissue Culture</td><td>Dish Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Serological Pipet, ポリスチレン, 個別包装, 滅菌ファ</td><td>ルコン</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td></td><td></td><td>バージョン: 13.0.1 (64-bit)</td></tr><tr><td>抗生物質 抗真菌剤溶液 (100回;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (cluster of differentiation 31)</td><td>Cell Marque</td><td>131M-95</td><td>モノクローナルマウス ab clone JC70</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)</td><td>DBS</td><td>Mob189-05</td><td>モノクローナルマウス ab, クローン 5D3</td></tr><tr><td>CKX41 倒立顕微鏡</td><td>オリンパス ライフサイエンス</td><td></td><td>オリンパス DP27 デジタルカメラ</td></tr><tr><td>切断カスパーゼ 3</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9661L</td><td>ポリクローナルウサギ ab</td></tr><tr><td>コラーゲン (ラットテール)</td> <td>ロシュ</td><td>11 179 179 001</td><td></td></tr><tr><td>コールター アイソトンII 希釈剤</td><td>ベックマンコールター</td><td>844 80 11</td><td>希釈液 II</td></tr><tr><td>コールター Z1, セルカウンター</td><td>コールターエレクトロニクス、ルートン、英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱水培養培地:Noble Agar</td><td>BD Difco</td><td>BD 214220</td><td></td></tr><tr><td>Dermal Microvascular Endothelial Neonatal, Pooled Donors (HMVEC-DNeo)</td><td>Lonza</td><td>CC-2516</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'のモディファイドイーグル」S 培地/栄養混合物 F-12 ハム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6434</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 内皮細胞増殖 基礎培地-2</td><td>ロンザ</td><td>190860</td><td></td></tr><tr><td>エチジウム ホモダイマー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46043</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清 (FCS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>SH30070</td><td></td></tr> 子<tr><td>牛胎児血清 Charcoal Stripped (FCS sf)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SH3006803</td><td></td></tr><tr><td>蛍光実体顕微鏡 ライカ M205 FA</td><td>ライカ マイクロシステム</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td>GlutaMAX Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, カルシウム, マグネシウム, フェノールレッド</td><td>ギブコ</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC &ndash;ヒト臍帯静脈内皮細胞</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health, USA</td><td></td><td>Wayne Rasband Version: 1.52a (64-bit)</td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Cell Marque</td><td>275R-16</td><td>monoclonal rabbit ab, clone SP6</td></tr><tr><td>Leica fully motorized fluorescence stereo microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Leica Histocore MulticutRotary Microtome</td><td></td><td>149MULTI0C1</td><td></td></tr><tr><td>Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)</td><td>Gibco</td><td>S003K</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 cells &ndash; ヒト乳房腺がん細胞株</td><td>Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich</td><td></td><td>Provived from Dr Andr&egrave;ATCC</td></tr><tr><td>Nunclon Sphera 96U-well plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>174925</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lysis Buffer</td><td>Cell Signaling, Danvers から入手した, USA</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1055</td><td></td></tr><tr><td>RNA Lysis Buffer</td><td>Zymo Research</td><td>R1060-1-100</td><td>Contents in Quick-RNA Miniprep Kit</td></tr><tr><td>Rotina 46R Centrifuge</td><td>Hettich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td><td>Falcon</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Bandelin electronics, ベルリン, DE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecan InfiniteシリーズM200マイクロプレートリーダーTecan</td><td>、ザルツブルク、AU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織培養フラスコ75</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr>トリ<tr><td>プシンEDTA溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924</td><td></td></tr></tbody></table>

乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

乳癌は女性の死亡率の主な原因である。乳癌細胞の増殖とその後の転移は、その進行の重要な要因である。MCF-7細胞などの乳がん細胞の単培養を用いて乳癌の増殖促進に関与するメカニズムは鋭意的に研究されているが、腫瘍増殖に密接に関与している血管およびリンパ系内皮細胞などの他の細胞タイプの寄与は、深く調べられていない。細胞間相互作用は、腫瘍の成長と進行において重要な役割を果たす。腫瘍の成長にはネオアン血管新生(血管の発達)が不可欠であるのに対し、リンパ系は癌細胞の移動とその後の転移のポータルとして機能する。最近の研究は、血管およびリンパ系内皮細胞が癌細胞の増殖に大きな影響を与えることができるという証拠を提供する。これらの観察は、より現実的にin vivoで乳癌の成長過程を反映するインビトロモデルを開発する必要性を意味する。さらに、動物研究における制限は、関連するメカニズムをより良く解明するためにex vivoモデルの開発を必要とする。
本稿では、乳癌細胞(エストロゲン受容体陽性MCF-7細胞)と血管および/またはリンパ内皮細胞の両方で構成される乳癌スフェロイドの開発について説明する。このプロトコルは、吊り下げ(ゴールドスタンダードと安価)と96ウェルUボトムプレート(高価)の2つの異なるアプローチを使用してデュアルセルスフェロイドを作成する詳細なステップバイステップアプローチを記述しています。形成されたスフェロイドを繊細に拾い上げ、微視的なサイジングによって成長を監視し、死んだ細胞染色と生きた細胞染色を使用して生存率を評価する方法について詳しく説明します。さらに、スフェロイドの成長パターンを区別するために増殖特異的抗体で切り離し染色するためのスフェロイドを固定する手順が線引く。さらに、トランスフェクションされた細胞を用いてスフェロイドを調製するための詳細と、分子解析のためにRNAを抽出する方法が提供される。結論として、この記事では、乳がん研究のための多細胞スフェロイドを準備するための詳細な手順を提供します。

上皮および内皮共培養を用いたスフェロイドモデルは、インビトロ実験のために乳房腫瘍のインビボ状態を密接に模倣する必要がある。図1のスキームは、乳癌上皮細胞および血管またはリンパ性内皮細胞を有するスフェロイドを形成するプロトコルを示している(図1)。各細胞タイプは、3.5cmの丸い皿に別々に播種され、成長刺激剤/阻害剤で処理されるか、またはリポフェクトアミンを用いたオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。上皮細胞または内皮細胞のコンフルエント単層は、トリプシン化後に収穫され、洗浄され、1:1の比率で混合される。細胞は、続いて96ウェルUボトムプレート(図1A)または10cm径の丸い培養皿の反転蓋にめっきされ、吊り下げ低下培養を容易にする(図1B)。播種直後、細胞は各ウェルの底部に平らで密な細胞シートとして現れ、その後、時間(24〜48時間)で凝集し、48時間で無傷の回...

乳腺上皮細胞と内皮細胞との間のクロストークは、乳癌の進行、腫瘍の増殖、転移に重要な貢献をする。本研究では、スフェロイドは、血管および/またはリンパ内皮細胞と共に乳癌細胞から作られ、乳癌研究のための インビトロ システムとしての適用性を実証した。

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

本明細書に記載の乳癌細胞スフェロイドは、癌細胞の増殖および転移に関与する癌細胞内皮細胞相互作用の分子機構を研究することを可能にする。この3Dモデルの主な利点は、乳がんの病態生理学と治療に関する推論の信頼性を向上させる、より現実的な細胞配置を提供することです。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生、ジョヴァンナ・アザリトです。メッキされた細胞を24時間、または望ましいように処理またはトランスフェクトすることから始めます。スフェロイドの細胞分布を識別するには、カルシウムとマグネシウムを含むハンクスバランス塩溶液またはHBSSの1ミリリットルで細胞を洗浄し、1ミリリットルの青色染料あたり0.5マイクログラムを使用してHUVECsにとどまります。そして、0.5マイクロモルグリーン色素を用いたMCF-7細胞を、増殖培地に関して希釈した。プレートを摂氏37度、CO2インキュベーター5%に30~40分間置きます。カルシウムとマグネシウムなしでHBSSの1ミリリットルで細胞を洗います。次に、HUVECの場合は0.25%のトリプシン、P1000ピペットを使用して各ブラウンディッシュに0.5%の回来である酵素剥離再剤を1ミリリットル加えます。各細胞タイプを5ミリリットルの丸底ポリスチレンチューブに分けて選び、P1000ピペットを使用して10%の胎児子牛血清またはFCS培地の1ミリリットルを加えて酵素反応を止めます。その後、細胞懸濁液をGの250倍で5分間遠心分離する。上清を慎重に吸引し、ステロイドフリー培地の1ミリリットルで細胞を中断します。各細胞懸濁液100マイクロリットルを希釈し、10ミリリットルの希釈液2を使用して、細胞の総数を決定します。セルカウンターバイアルでDiluent 2溶液を使用して、機能と開始ボタンを押すことによって、マシンとフラッシュをオンにします。4として設定し、新しいDiluent 2溶液でブランクを測定するためにスタートを押してください。希釈液2溶液の10ミリリットルで細胞懸濁液の100マイクロリットルでシンチレーションバイアルを変更します。4として設定し、サンプルを測定するためにstartを押してください。デジタルディスプレイ上のミリリットル当たりの細胞数に注意し、各セルサスペンションの5ミリリットルを調製し、それらを混合して1対1の比率で10ミリリットルの最終体積を得るために、手動繰り返しピペットを使用して、96ウェルUボトムプレートの各ウェルに100マイクロリットルの細胞懸濁液をピペットアウトします。プレートを標準的な組織培養条件下でインキュベーターに入れ、48時間後にスフェロイドの形成を確認します。この回転楕円体を40 X倍率で、位相コントラストまたは蛍光ステレオ顕微鏡で撮影します。吊り落ちる培養液を調製するために、細胞懸濁液を1対1の比率で混合し、2ミリリットルの最終体積を得る。P20ピペットを使用して、10センチメートルのペトリ皿の反転したリードに15マイクロリットルの滴の形で細胞混合物を見てください。蓋を滴で反転させ、皿の底に5ミリリットルのEBM-2ベース培地を加えて、滴の蒸発を避けます。P200マイクロリットルピペットの腸先端を備えた1.5ミリリットルチューブに約50個のスフェロイドを集める。重力でチューブの底に落ち着き、上清を捨てます。4%PFAの500マイクロリットルを室温で1時間固定します。PBSで2%ノーベルアルゴール溶液を沸騰させ、磁気攪拌付きのホットプレートを3〜5分間使用してオーガラスパウダーを完全に溶解し、摂氏60度前後まで冷却します。P1000ピペットでPFAを取り出し、このスフェロイドを500マイクロリットルのPBSで洗い、堆積物にします。落ち着いたら、慎重にアゴラ溶液のピペット600マイクロリットルをスフェロイドで1.5ミリリットルチューブに捨て、水平ローターで水平ローターを持つ遠心分離機に2分間直ちにチューブを入れます。Agroソリューションの途中に短い文字列を追加して、チューブからプラグを簡単に取り外します。氷の上にアグロスプラグを固めるか、または4度でペレットを乾燥させないように1.5ミリリットルチューブにPBSの500マイクロリットルを追加します。ステレオ顕微鏡を用いて、スフェロイド切片の画像を取得します。EBM-2を使用して希釈したカルシウムアムとエチジウムホモ二量体の混合物のウェルあたり10マイクロリットルを1〜50の比率で添加するために必要な溶液の量を計算する。染色混合物をスフェロイドに加え、プレートを標準の下でインキュベーターに入れ、組織培養条件を30〜60分間行う。蛍光ステレオ顕微鏡を用いて40 X倍率で写真を取得します。U-底板では、スフェロイド形成はMCF7細胞の播種後48時間観察された。しかし、内皮細胞やリンパ球細胞の場合にはスフェロイド形成は認められなかった。MCFに7個のプラス内皮細胞またはMCF 7プラスリンパ細胞を1対1の比率で播種することも、スフェロイド形成をもたらした。MCF 7回転楕円体の時間依存順次成長は24〜120時間の範囲で記録された。スフェロイドのサイズは5日間で約100マイクロメートルから約200マイクロメートルに増加しました。成長刺激剤で処理されたスフェロイドで観察された増加した成長速度を有する。スフェロイドの構造およびその細胞の形状は、リポフェクトアミンの存在下でオリゴヌクレオチドを制御した後の異常を示さなかった。これらの増殖マーカーKi-67を発現する細胞は、このスフェロイド中に均一に分布した。このスフェロイドのカスパーゼに3回染色して切断すると、4日間培養した後に無関心細胞が示された。CD-31およびKi-67を使用したこのスフェロイドの細胞の研究は、細胞の55%が上皮45%であり、細胞の25%が増殖していることを明らかにした。生細胞および死んだ細胞の割合を評価するために、4日齢のスフェロイドをカルシウムアムとエチジウム・ホモメーターで染色した。新しい考えのスフェロイドはまた、死んだ細胞と生きた細胞のために染色し、スフェロイドは凍結状態に非常に敏感であることを明らかにしました。彼のプロトコルに従うとき、健康な細胞がアフロディーテを混合するために使用されていることを確認覚えておくべきこと覚えておくべきことは、DPキャップ中にこれらのアフロディーテを損傷することを避けることであり、重合する前にアフロディーテを口蓋する良いセクションを確保することです。このモデルは、腫瘍の進行に関与する線維芽細胞などの他の細胞を含め、それを使用して癌増殖を標的とする治療薬の有効性を評価することによってさらに改善することができる。

mammary-epithelial-endothelial-cell-spheroids-as-potential-functional

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

定量的形質転換成長因子（TGF）-β誘導性3次元コラーゲンゲル内侵入を測定するアッセイが記載されている。このアッセイでは、乳がんの開発のさまざまな段階を表現する細胞株のMCF10Aシリーズ、を活用しています。このメソッドは、他の細胞株で使用できるように採用することが可能と侵略の他の潜在的な活性化剤または阻害剤を調査するために使用される可能性があります。...

TGF -β誘発性浸潤を測定する回転楕円体アッセイ

簡単な方法は、関連付けられている上皮細胞上の組織線維芽細胞に及ぼす影響を分析するために記述されています。このメソッドは、三次元組織培養の組み合わせにより、3Dから分離後の細胞の分析を容易にすることができます。技術は、腫瘍細胞上の腫瘍関連間質の効果の系統的な研究を可能にする、悪性度を変化させるセルに適用されます。...

三次元混合細胞スフェロイド共培養から乳腺上皮細胞の分離

無傷の組織オルガノイドを用いた初代培養細胞は、多細胞のin vivoでの微小環境を模倣するモデル系を提供する。我々は、酵素的組織破壊することなく、形態分化混合細胞培養系統や展示を永続無血清原発性乳房上皮組織培養モデルを開発した。乳オルガノイド&gt;は6ヶ月間生存したまま。...

マンモスフィアの自然発生の事前侵襲乳房病変の非酵素的、無血清組織培養

ホルモン作用を研究するのに適したヒトの乳房上皮の3D培養モデルを記述します。...

ヒト乳腺上皮のホルモン応答性の3D培養モデル

この原稿は、細胞外マトリックスに囲まれた定義された幾何学的形状の3次元（3D）上皮組織の均一な配​​列を操作するソフトリソグラフィーベースの技術が記載されています。この方法は、細胞の種類および実験の文脈の多種多様に適していると同一の​​複製のハイスループットスクリーニングを可能にします。...

細胞外マトリックス内に埋め込まれたエンジニアリング三次元上皮組織

患者由来異種移植片(PDX)モデルおよび移植可能な遺伝子組み換えマウスモデルは、ヒト疾患を忠実に再現し、基礎的および翻訳的な乳癌研究のための好ましいモデルである。ここで、乳房腫瘍断片を乳腺脂肪パッドに整形移植して腫瘍生物学を研究し、薬物反応を評価する方法について説明する。...

乳癌の前臨床モデルとしての乳房腫瘍の移植性

このプロトコルは、ヒト乳腺細胞の形質転換を評価するための実験的なインビトロツールを提供する。細胞増殖率、アンカレッジ非依存性増殖能、基基膜マトリックスを用いた3D培養における細胞系統の分布をフォローアップするための詳細なステップについて説明する。...

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

このプロトコルの目的は、多細胞スフェロイドとして乳房上皮細胞を、薬物スクリーニング研究に使用できる3D乳房内皮共培養モデルを迅速に作成するために、多細胞性スフェロイドとして直接バイオプリントすることです。...

内皮ネットワーク上の3D多細胞乳房スフェロイドの直接バイオプリンティング

関連するヒト疾患を忠実に再現する包括的な インビトロ モデルが欠けている。現在の研究は、ヒト肝細胞癌における腫瘍間質相互作用を研究するための信頼性の高い インビトロ...

肝細胞癌における腫瘍間質相互作用を調べる三次元スフェロイドモデル

このプロトコルでは、一次正常および腫瘍乳腺組織から差動遠心分離によって上皮オルガノイドを生成するためのアプローチについて説明します。さらに、包埋オルガノイドの3次元培養および免疫蛍光イメージングのための説明書が含まれています。...

継代なしの正常および腫瘍乳腺組織からのマウスおよびヒト上皮オルガノイドの生成とイメージング

がんの転移を研究するためには、ヘテロセルのクロストークを捉える3Dがんモデルが急務となっています。私たちの研究は、侵入と細胞空間分布の研究に使用できる足場および足場のない環境でのヘテロ多細胞間質-上皮の生成を示しています。...

上皮癌細胞のスキャフォールドフリー3D培養におけるヘテロ多細胞間質細胞による浸潤の促進

学ぶ乳がん研究における乳腺上皮細胞と内皮細胞の相互作用を3Dスフェロイドモデルで解析する方法。がん細胞の増殖と転移の分子メカニズムを解明し、治療戦略の開発に貢献する信頼性の高いインビトロ系を構築します。

乳がん研究のための潜在的機能インビトロモデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

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