冈 比亚按蚊 幼虫唾液腺的解剖和免疫染色

昆虫的唾液腺，是传播许多人类疾病所必需的。因此，对工资腺生物学的更好理解应该有助于我们，增加现有的疾病预防策略。这项技术将使我们能够快速询问候选调节因子的突变是否影响蚊子幼虫唾液腺的形态，并可能影响疟疾寄生虫的传播。

在您与蚊子幼虫一起工作的前几次，由于它们快速移动，因此很难掌握它们。你练习的越多，你就越好。开始手术的将是Marisol Luchetti，我实验室的本科生研究助理。

要开始实验，将便盆放在解剖显微镜的载物台上，然后将10只蚊子L4幼虫转移到便盆上。然后将一滴解剖液滴到与幼虫分开的便盆上。使用镊子将一个L4幼虫放入25%乙醇的解剖液中。

通过每只手握住五个镊子，用镊子在头部正下方，用惯用手抓住幼虫的头部，然后用非惯用手握住幼虫的头部，然后以最小的恒定力轻轻拉动头部，以脱离身体的其余部分，同时腺体仍然附着在头部上。丢弃幼虫尸体的身体部分后，将头部或唾液腺收集到1毫升PBS中，放入1.5毫升微量离心管中，并等待唾液腺沉入缓冲液的底部。第二天，沥干溶液以固定组织，用一毫升冷的100%丙酮90秒。

取出丙酮后，用一毫升PBS轻轻冲洗组织三次。对于免疫染色，以适当的稀释度加入一抗，如Rab 11，在PBS总体积的200微升中。用移液器吸头轻轻旋转试管内容物。

将一抗在四度下孵育过夜，然后在一毫升PBS中洗涤三次。然后加入二抗Alexa Fluor 488 Goat抗兔药，以适当的稀释度，在总体积的200微升中。用移液器吸头混合内容物后，将含有染料（如尼罗河红和Hoechst）的组织在室温下孵育至200微升PBS中60分钟，然后用PBS洗涤三次。

准备显微镜载玻片，用移液器加入200微升100%甘油，并使用软刷子转移多达20个染色的头部，附着的腺体和内部结构。将头部样品展开，沿载玻片均匀分布。在解剖显微镜下观察，使用两对镊子将幼虫头部与腺体分开，小心地将两个组织向相反的方向拉动。

当所有样品完成后，轻轻地将1.5毫米厚的盖玻片放在载玻片的顶部，避免形成气泡，然后用透明的指甲油密封载玻片。唾液腺相对容易从第四阶段幼虫中解剖。雄性和雌性幼虫在L4幼虫晚期可以通过红色条纹沿着雌性的背胸来区分。

触角形态也更加精细，可以看到雄性比雌性L4幼虫更精细，白色箭头指向，雌性触角在左边图像上，雄性触角在右边。从早期L4期幼虫中分离出的唾液腺，用Hoechst染色，露出近端和远端叶，由狭窄的收缩分开。在免疫染色的远端唾液腺中，检查中晚期L4幼虫的形成腔。

分泌细胞的顶端结构域，围绕形成的腔体具有强烈的尼罗河红色染色，提示微绒毛状结构。在靠近顶端表面的地方观察到Rab 11染色。随着时间的流逝，只有一个步骤，那就是90秒的孵育，冷丙酮中的组织。

该协议是最近才制定的，但我们预计它将对任何研究蚊子唾液腺的人有所帮助。我们完全期望经常使用它。