Name: Caenorhabditis elegans는 Polyglutamine-mediated Neurotoxicity에 대한 생리 활성 화합물을 발견하기위한 모델 시스템으로서의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 탐색하세요 Caenorhabditis elegans를 활용한 폴리글루타민 신경독성에 대한 신경보호 화합물 스크리닝 방법을. 다중 표현형 분석으로 헌팅턴 병 치료 후보 물질을 평가하고 신경세포 생존률과 회피 행동을 정량화하여 신경퇴행성 질환 연구에 활용하세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는이 논문에 사용 된 프로토콜을 개발하고 개선하는 데 도움을 준 Huang Lab의 전 회원, 특히 Hanrui Zhang, Lingyun Xiao 및 Yanxia Xiang에게 감사드립니다. 이 작업은 111 프로젝트 (보조금 번호 B17018)와 허베이 성 자연 과학 재단 (보조금 번호 H2020207002)의 지원을 받았습니다.

참고: 이 프로토콜에 사용된 솔루션의 제조법은 표 1 을 참조하십시오.
1. 예쁜꼬마 선충 분석용 물질의 제조
<ol><li>C. elegans 균주의 유지 보수<ol>
<li>C. elegans (AM141 및 HA759) 및 에스케리치아 콜라이 (OP50 및 NA22) 균주를 얻었다 (표 재료 참조).</li>
		<li>선충류를 선충류 성장 배지 (NGM) 플레이트 상에 유지시키고 대장균 OP50으로 시딩하여 AM141에 대해 20°C에서21 또는 HA75923에 대해 15°C에서 유지한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>대장균 OP50 세균 배양액의 제조<ol>
<li>Luria-Bertani (LB) 줄무늬 플레이트에서 대장균 OP50의 단일 콜로니를 골라 50 mL의 액체 LB 배양물에 접종하십시오.</li>
		<li>OP50 박테리아를 570 nm에서 ∼0.5의 광학 밀도가 될 때까지 37°C 및 200 rpm의 진탕기에서 인큐베이션한다 (OD570).</li>
		<li>OP50 박테리아 배양물을 4°C에서 보관하고 2주 이내에 사용한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>OP50 박테리아를 사용한 NGM 플레이트의 제조<ol>
<li>한천 20g, 펩톤 2.5g, NaCl 3.0g, 탈이온수 975mL를 1L 오토클레이브 병에 담는다. 121°C에서 30분 동안 오토클레이브.</li>
		<li>액체 NGM 한천 병을 벤치에 올려 놓고 ~60°C로 냉각한 다음, 1 MCaCl2 1 mL, 1 M MgSO4 1 mL, 5 mg/mL 콜레스테롤 1 mL, 1 M 인산칼륨 25 mL (pH 6.0) 등의 멸균 원액을 첨가한다.</li>
		<li>NGM 20mL를 멸균된 90mm 페트리 접시에 붓고 플레이트를 벤치에 두어 식히고 응고시킵니다. 접시를 거꾸로 유지하고 실온에서 벤치에서 2 일 동안 말리십시오.</li>
		<li>OP50 박테리아 배양물 200 μL를 각 NGM 플레이트 상에 분주하고 멸균 유리 코팅 막대로 고르게 퍼뜨린다. 뚜껑을 닫고 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>OP50으로 시드된 NGM 플레이트를 실온에서 덮개가 있는 플라스틱 박스에 보관하고 2주 이내에 사용하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>연령 동기화된 C. elegans 집단의 제조<ol>
<li>과립성인 선충류를 멸균된 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣고 1000 × g 에서 1분 동안 원심분리한다. 세 번 씻고 선충류를 M9 완충액에 재현탁하십시오.</li>
		<li>같은 양의 표백제를 넣고 3-5 분 동안 부드럽게 교반하십시오. 해부 현미경으로 15 초마다 표백을 모니터링하십시오. 참고: 표백제 용액은 동량의 10% NaOCl과 1M NaOH(표 1)20을 혼합하여 사용 전에 신선하게 준비해야 합니다.</li>
		<li>선충류의 대부분이 부러지면 M9 버퍼로 희석하여 소화를 중단하십시오. 신속하게 원심분리하여 상층액을 제거하고 펠렛을 M9 완충액에 재현탁시켜 세척을 세 번 반복한다.</li>
		<li>펠렛을 S 배지에 재현탁시킨다. 선충류 잔류 물이 중력에 의해 2-3 분 동안 정착하게하고 계란은 상청액에 남아 있습니다.</li>
		<li>상청액을 새로운 멸균 마이크로 원심분리 튜브로 흡인하십시오. 1분 동안 1000 × g 에서 원심분리하여 알을 수집한다.</li>
		<li>상층액의 ~ 80 %를 버리고 계란을 20 mL의 S 배지가 들어있는 멸균 플라스크로 옮깁니다. 플라스크를 진탕기에 넣고 120 rpm에서 음식없이 하룻밤 동안 계란을 배양하여 동기화 된 L1 선충류를 얻었다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PolyQ 응집 분석
<ol><li>polyQ 응집 분석을 위한 선충류의 제조<ol>
<li>AM141의 300-500 동기화된 L1 유충을 OP50 (0.7-0.8의 OD570) 및 5 mg/mL의 아스트라갈란을 함유하는500 μL의 S 배지와 함께 48-웰 플레이트의 각 웰로 옮긴다.</li>
		<li>플레이트를 파라필름으로 밀봉하고, 20°C 및 120 rpm에서 24, 48, 72, 및 96 h 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>선충류를 멸균된 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에서 수확하고 M9 완충액으로 세척하여 &gt;3회 원심분리(1분 동안 1000 × g )하여 잔존하는 OP50을 제거하였다. AM141 선충류를 M9 버퍼에 재현탁하고 이미지 획득 준비를 유지하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>형광 이미지 수집 및 데이터 분석 참고: 데이터는 이 고함량 이미징 시스템으로 자동으로 분석됩니다. 자동화된 영상화 장치를 사용할 수 없는 경우, 영상 획득을 위한 아가로스 패드를 제조하는 종래의 방법은 일반적인 형광 현미경 7,15,17을 사용하여 유사한 성능을 달성하는데 사용될 수 있다(단계 3.2 및 3.3 참조).<ol>
<li>10-15 선충류를 384-웰 플레이트 (웰 당 최종 부피 80 μL)의 각 웰로 옮깁니다. 각 치료에 대해 10개의 복제 웰을 설정합니다.</li>
		<li>각 웰에 200mM 아지드 나트륨 10μL를 첨가하여 선충류를 마비시키고 바닥까지 가라앉히게 한다(5-10분).</li>
		<li>플레이트를 고함량 이미징 시스템에 배치하여 형광 이미지를 획득하십시오(장치 및 소프트웨어 정보에 대한 자료 표 참조).</li>
		<li>이미지 수집 소프트웨어를 열고 다음 매개 변수를 설정합니다.<ol>
<li>플레이트 획득 설정 창을 열고 새 실험 세트와 이름을 생성합니다.</li>
			<li>배율을 2배로, 카메라 비닝을 1로, 플레이트 유형을 384웰 플레이트로 선택합니다.</li>
			<li>방문 할 우물과 사이트 (단일 사이트)를 설정하십시오.</li>
			<li>플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 필터를 선택하고 이미지 기반 초점 옵션을 활성화합니다.</li>
			<li>노출을 300ms로 설정합니다. 참고: 위의 설정은 이미징 파라미터를 최적화하기 위해 테스트하고 조정할 수 있습니다.</li>
			<li>이미지 수집 설정을 저장하고 플레이트 획득 버튼을 클릭하여 실행하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지 데이터를 분석합니다.<ol>
<li>플레이트 데이터 검토 창을 열고 이미지 분석을 위한 테스트 플레이트를 선택합니다.</li>
			<li>테스트 웰을 두 번 클릭하여 해당 이미지를 표시합니다.</li>
			<li>분석 방법으로 핵 수를 선택하고 설정 구성 버튼을 클릭하여 다음 설정에 대한 창을 불러옵니다.</li>
			<li>FITC 채널에서 소스 이미지를 정의하고 표준 알고리즘을 선택합니다.</li>
			<li>이미지 분석 파라미터를 다음과 같이 설정한다: 대략적인 최소 폭 = 10 μm (= 2 픽셀); 대략적인 최대 너비 = 50 μm (= 12 픽셀); 지역 배경 위의 강도 = 1,000-2,000 회색 수준.</li>
			<li>현재 설정을 테스트하여 분석 방법을 최적화합니다.</li>
			<li>설정을 저장하고 모든 웰에서 분석을 실행합니다. 참고: 하나의 384웰 플레이트에 대한 분석을 완료하는 데 ~20분이 걸립니다.</li>
			<li>총 핵을 각 웰의 Q40::YFP 응집체의 총 수로 내보냅니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>각 우물에있는 선충류의 수를 계산하십시오.</li>
		<li>각 그룹의 선충류 당 Q40::YFP 응집체의 평균 수를 계산하고 각 시점의 데이터에 비선형 곡선을 적용합니다.</li>
		<li>아래의 eq (1)을 사용하여 억제 지수를 계산하십시오. 억제 지수 = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63081/63081eq01.jpg"> (1) 여기서 N 대조군 및 N샘플은 각각대조군 및 치료군에서의 Q40::YFP 응집체의 평균 수이다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. PolyQ 매개 신경독성 분석
<ol><li>시험 표본을 사용한 C. elegans의 치료<ol>
<li>polyQ 신경독성 분석을 위한 선충류를 제조하기 위해, HA759의 300-500 동기화된 L1 유충을 OP50 (0.7-0.8의 OD570) 및 5 mg/mL의 아스트라갈란을 포함하는500 μL의 S 배지가 있는 48-웰 플레이트의 각 웰로 옮긴다.</li>
		<li>플레이트를 파라필름으로 밀봉하고, 15°C 및 120 rpm에서 3일 동안23일 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>원심분리로 선충류를 수집하고 M9 완충액으로 3-5 번 세척하십시오. 선충류를 M9 완충액에 재현탁시켜 뉴런 생존 및 회피 분석에 사용하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>아가로스 패드의 제조<ol>
<li>M9 버퍼 100mL(2%, w/v)에 아가로스 2g을 넣고 전자레인지에서 아가로스 용액을 가열하여 거의 끓인다.</li>
		<li>용융된 아가로오스 0.5 mL를 2mm 두께의 유리판 두 조각 사이에 놓인 1mm 두께의 현미경 유리 슬라이드의 중앙에 분배한다. 다른 슬라이드로 세로로 덮습니다. 아가로스가 식고 응고되면 상단 슬라이드를 부드럽게 제거하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ASH 뉴런 생존 분석<ol>
<li>아가로스 패드 상에 20 mM 소듐 아지드의 방울을 첨가한다. 15-20 HA759 선충류를 방울로 옮겨 고정시킵니다.</li>
		<li>커버 슬립을 선충류 위에 부드럽게 놓습니다. 슬라이드를 디지털 카메라가 장착된 형광 현미경 아래에 보관하십시오. 40x 대물 렌즈와 FITC 필터를 선택하여 선충류의 머리 영역에서 GFP 양성 ASH 뉴런을 검출하십시오.</li>
		<li>각 그룹에서 50 개 이상의 선충류를 무작위로 선택하여 머리 영역에 GFP 표지 된 양측 ASH 뉴런이있는 선충류의 수를 계산하십시오7. 아래의 eq (2)를 사용하여 ASH 뉴런의 생존율을 계산하십시오. 뉴런 생존율(%) = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63081/63081eq02.jpg"> (2) 여기서 N생존 및 N총 계는 GFP 양성 ASH 뉴런을 가진 선충류의 수와 각 그룹에서 각각 시험된 선충류의 수이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>삼투압 회피 분석<ol>
<li>무식품 NGM 플레이트 (9cm)를 중간에 8M 글리세롤 (~ 30 μL) 라인으로 정상 (N) 및 트랩 (T) 구역으로 나눕니다. 글리세롤 라인으로부터 ∼1 cm 떨어진 곳에 200 mM 소듐 아지드(∼20 μL) 라인을 퍼뜨려 글리세롤 장벽을 통과하여 구역 T로 횡단하는 선충류를 마비시킨다.</li>
		<li>각 그룹에 대해 세 개의 복제 플레이트의 영역 N에 각각 ~ 200 개의 선충류를 옮깁니다. 선충류를 유인하기 위해 Zone T (플레이트 가장자리에서 1cm)에 1 % 부탄디온 (~ 2 μL)을 떨어 뜨립니다. 페트리 접시의 뚜껑을 즉시 덮고, 23°C에서 90분 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>현미경으로 N 및 T 구역의 선충류 수를 채점하십시오. eq (3)20을 사용하여 회피 지수를 계산하십시오. 회피 지수 = <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63081/63081eq03.jpg"> (3) 여기서 N과 T는 각각 N 및 T 구역 내의 선충류의 수이다. 데이터는 ±3 독립적인 실험을 대표&gt;는 3번의 반복실험의 표준 편차(SD)의 평균으로 제시된다.</li>
		<li>쌍을 이루지 않은 두 꼬리 t-검정을 수행하여 황기와 대조군의 데이터를 비교합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 레이더 차트 만들기
<ol><li>그래프 소프트웨어를 열고 다른 분석의 데이터를 새 시트로 가져옵니다. A(X) 열을 방사형 축의 제목으로, A(Y) 열을 대조군의 데이터로, B(Y) 열을 치료 그룹의 데이터로 입력합니다.</li>
	<li>필요한 데이터를 선택하고 플롯을 클릭 | 전문화: 도구 모음 메뉴의 레이더 버튼을 사용하여 레이더 차트를 생성합니다.</li>
	<li>방사형 축을 두 번 클릭하고 필요에 따라 각 축의 배율, 눈금 및 눈금 레이블을 조정합니다.</li>
	<li>메뉴에서 파일을 클릭하고 그래프 내보내기를 선택하여 이미지를 *.tiff로 저장합니다. 참고: 자료 표의 소프트웨어 웹 사이트는 레이더 차트 작성에 대한 자세한 도움말 문서 및 비디오 자습서를 제공합니다.</li>
</ol>

<ol><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Bauer, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+chaperone-mediated+autophagy+for+the+selective+degradation+of+mutant+huntingtin+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein.</a> Nature Biotechnology. 28 (3), 256-263 (2010).</li>
<li>Lieberman, A. P., Shakkottai, V. G., Albin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+repeats+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine repeats in neurodegenerative diseases.</a> Annual Review of Pathology. 14, 1-27 (2019).</li>
<li>Sakahira, H., Breuer, P., Hayer-Hartl, M. K., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+as+modulators+of+polyglutamine+protein+aggregation+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones as modulators of polyglutamine protein aggregation and toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 4 16412-16418 (2002).</li>
<li>Bäuerlein, F., Fernández-Busnadiego, R., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+structure+of+neurotoxic+protein+aggregates+inside+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Investigating the structure of neurotoxic protein aggregates inside cells.</a> Trends in Cell Biology. 30 (12), 951-966 (2020).</li>
<li>Tu, Z., Yang, W., Yan, S., Guo, X., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9%3A+a+powerful+genetic+engineering+tool+for+establishing+large+animal+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9: a powerful genetic engineering tool for establishing large animal models of neurodegenerative diseases.</a> Molecular Neurodegeneration. 10, 35(2015).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+polyglutamine-mediated+proteotoxicity+by+Astragalus+membranaceus+polysaccharide+through+the+DAF-16%2FFOXO+transcription+factor+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Inhibition of polyglutamine-mediated proteotoxicity by Astragalus membranaceus polysaccharide through the DAF-16/FOXO transcription factor in Caenorhabditis elegans.</a> Biochemical Journal. 441 (1), 417-424 (2012).</li>
<li>Koyuncu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+UBR5+suppresses+proteostasis+collapse+in+pluripotent+stem+cells+from+Huntington%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase UBR5 suppresses proteostasis collapse in pluripotent stem cells from Huntington's disease patients.</a> Nature Communications. 9 (1), 2886(2018).</li>
<li>Dimitriadi, M., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+disorders%3A+insights+from+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative disorders: insights from the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Neurobiology of Disease. 40 (1), 4-11 (2010).</li>
<li>Li, J., Le, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neurodegenerative+diseases+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Neurology. 250, 94-103 (2013).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+in+Chinese+medicinal+studies%3A+making+the+case+for+aging+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans in Chinese medicinal studies: making the case for aging and neurodegeneration.</a> Rejuvenation Research. 17 (2), 205-208 (2014).</li>
<li>Hassan, W. M., Dostal, V., Huemann, B. N., Yerg, J. E., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+A%CE%B2-specific+pathogenic+mechanisms+using+a+nematode+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Identifying Aβ-specific pathogenic mechanisms using a nematode model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiology of Aging. 36 (2), 857-866 (2015).</li>
<li>Faber, P. W., Alter, J. R., MacDonald, M. E., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine-mediated+dysfunction+and+apoptotic+death+of+a+Caenorhabditis+elegans+sensory+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine-mediated dysfunction and apoptotic death of a Caenorhabditis elegans sensory neuron.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (1), 179-184 (1999).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+and+neuroprotective+effects+of+Dictyophora+indusiata+polysaccharide+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Antioxidant and neuroprotective effects of Dictyophora indusiata polysaccharide in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Ethnopharmacology. 192, 413-422 (2016).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epimedium+polysaccharide+alleviates+polyglutamine-induced+neurotoxicity+in+Caenorhabditis+elegans+by+reducing+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Epimedium polysaccharide alleviates polyglutamine-induced neurotoxicity in Caenorhabditis elegans by reducing oxidative stress.</a> Rejuvenation Research. 20 (1), 32-41 (2017).</li>
<li>Zhong, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+and+geroprotective+comparison+of+Nostoc+sphaeroides+polysaccharides+across+colony+growth+stages+and+with+derived+oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Phycology%22%5BJournal%5D)">Physicochemical and geroprotective comparison of Nostoc sphaeroides polysaccharides across colony growth stages and with derived oligosaccharides.</a> Journal of Applied Phycology. 33 (2), 939-952 (2021).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+protects+Caenorhabditis+elegans+neurons+from+polyglutamine-mediated+toxicity+by+reducing+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Salidroside protects Caenorhabditis elegans neurons from polyglutamine-mediated toxicity by reducing oxidative stress.</a> Molecules. 19 (6), 7757-7769 (2014).</li>
<li>Cordeiro, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rutin+protects+Huntington%27s+disease+through+the+insulin%2FIGF1+%28IIS%29+signaling+pathway+and+autophagy+activity%3A+Study+in+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Rutin protects Huntington's disease through the insulin/IGF1 (IIS) signaling pathway and autophagy activity: Study in Caenorhabditis elegans model.</a> Food and Chemical Toxicology. 141, 111323(2020).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroprotective+and+lifespan-extension+activities+of+Damnacanthus+officinarum+extracts+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">The neuroprotective and lifespan-extension activities of Damnacanthus officinarum extracts in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Ethnopharmacology. 141 (1), 41-47 (2012).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+traditional+formula+Kai-Xin-San+alleviates+polyglutamine-mediated+neurotoxicity+by+modulating+proteostasis+network+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">The traditional formula Kai-Xin-San alleviates polyglutamine-mediated neurotoxicity by modulating proteostasis network in Caenorhabditis elegans.</a> Rejuvenation Research. 23 (3), 207-216 (2020).</li>
<li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li>
<li>Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+disruption+of+cellular+protein+folding+in+models+of+polyglutamine+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases.</a> Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).</li>
<li>Voisine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+therapeutic+drugs+for+huntington%27s+disease+using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of potential therapeutic drugs for huntington's disease using Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 2 (6), 504(2007).</li>
<li>Faber, P. W., Voisine, C., King, D. C., Bates, E. A., Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine%2Fproline-rich+PQE-1+proteins+protect+Caenorhabditis+elegans+neurons+from+huntingtin+polyglutamine+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Glutamine/proline-rich PQE-1 proteins protect Caenorhabditis elegans neurons from huntingtin polyglutamine neurotoxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 17131-17136 (2002).</li>
</ol>

저자들은 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

polyQ 응집 및 단백질 독성은 헌팅턴병13과 같은 polyQ 장애의 중요한 특징이므로, AM141 균주의 polyQ 응집 분석, HA759 균주에서의 ASH 뉴런 생존 분석, HA759 균주에서의 화학감각 회피 검정을 포함하는 시험 화합물의 신경 보호 능력을 종합적으로 평가하기 위해 여러 모델 및 방법의 사용을 권장합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 polyQ 응집 및 관련 신경 독성 7,14,15,16,17,19,20에 대한 억제 효과를 포함하여 polyQ 독성에 대한 테스트 샘플의 신경 보호 능력을 평가하는 데 사용되어 HD 및 기타 polyQ 질환에 대한 약물 발견에서의 잠재력을 입증합니다.
자동화된 이미징 및 분석 시스템이 polyQ 응집체 분석에서 폴리Q 응집체의 검출 및 계수를 위해 도입된다. 이 방법은 높은 처리량과 시간 효율적이라는 장점이 있으며 까다로운 계산 프로세스에서 주관적인 오류를 크게 줄입니다. 전체 384웰 플레이트의 경우 이미지 수집 및 분석을 완료하는 데 <1시간 밖에 걸리지 않습니다. 그러나, 종래의 현미경 영상화 방법도 자동화 영상화 장치(7)를 사용하지 않고 이 실험실에서 유사한 성능을 나타내었다. 
치료 당 총 100-150 선충류는 각 시점마다 전형적인 Q40::YFP 응집 분석에서 권장되며, 이는 각각 10-15 개의 선충류를 함유 한 복제 웰에서 수행 할 수 있습니다. 그러나 L1 유충은 일부 치료 또는 더 높은 농도에 더 민감 할 수 있습니다. 따라서, 시험 화합물의 더 높은 투여량은 그들의 성장을 억제할 수 있고, 느린 성장으로 인한 위양성 결과를 초래할 수 있고, 따라서, 지연된 polyQ 응집으로 인해. 보통, 식품 클리어런스 분석은 이러한 우려를 해결하고 시험 화합물23의 적절한 농도 범위를 보장하기 위해 수행될 수 있다. 
polyQ 신경독성 분석에 사용되는 HA759 형질전환 선충류는 OSM-10::GFP 및 Htn-Q150을 공동 발현하므로 양측 ASH 감각 뉴런을 명확하게 식별할 수 있습니다. 따라서, ASH 뉴런 생존은 GFP 발현의 존재 또는 부재에 의해 평가되고; 일반적으로 통제 선충류의 ASH 뉴런의 ~ 40-75 %는23,24 명이 사망했습니다. 흥미롭게도, HA759 균주에서 pqe-1(폴리글루타민 인핸서-1) 유전적 돌연변이 배경(pqe-1; Htn-Q150)은 polyQ 매개 독성을 가속화하여 15°C에서도 3일 이내에 대부분의 ASH 뉴런의 사멸을 유도하며, 따라서 이 균주는 이전에 보고된23,24와 같이 뉴런 생존 분석을 위해 15°C에서 성장한다.
HA759 선충류에서 ASH 뉴런의 기능적 손실은 세포 사멸 및 단백질 응집체의 검출 전에 발생할 수 있다13; 따라서, 삼투압 회피 거동 분석은 폴리Q 매개 독성의 평가에 필수적이다. 저온에서 덜 활성인 HA759 선충류가 행동 실험에 미치는 잠재적 영향을 최소화하기 위해, 회피 분석 플레이트는 이 균주를 사용하는 뉴런 생존 분석에서와 같이 15°C에서가 아니라 가습된 23°C 인큐베이터에서 인큐베이션된다. 또한, Htn-Q150/OSM-10::GFP 형질전환 선충류는 코 접촉에 매우 민감하다는 것이 보고되었다; 따라서, ASH 뉴런 기능의 대안적인 검출은 코 터치 분석(13)이다.

HD에서의 진행성 신경변성은 CAG 트리뉴클레오타이드 반복 1,2,3에 의해 코딩되는 폴리Q의 비정상적인 스트레치를 갖는 병원성 돌연변이 헌팅틴을 수반한다. 37개 이상의 글루타민 반복을 갖는 돌연변이 헌팅틴 단백질은 헌팅턴병 환자와 동물 모델4,5의 뇌에 응집되어 축적되기 쉬우며, 이는 궁극적으로 신경변성6을 유도한다. 질병 병리학5에서 polyQ 응집체의 역할에 대한 명확성이 부족함에도 불구하고, 폴리Q 응집 및 그의 관련 독성의 억제는 HD 및 다른 폴리Q 질환4,7,8에 유용한 치료 전략이다.
신경 신호 전달 경로의 보존과 구축하기 쉬운 트랜스제닉 질환 모델로 인해, 예쁜꼬마선충은 신경 장애9,10,11,12의 조사를 위한 주요 모델 유기체로서 널리 이용되고 있다. 예를 들어, 응집되기 쉬운 폴리Q 확장을 발현하는 트랜스제닉 C. 엘레간 모델은 선택적 뉴런 세포 손실, 세포질 응집체 형성, 및 행동 결함(13)과 같은 HD 유사 특징을 객관적으로 모방할 수 있다. 확립된 폴리Q 선충류 모델에서 이러한 표현형을 역전시키는 시험 샘플의 잠재적 효과에 대한 조사는 다양한 유망한 치료 후보, 예를 들어, 다당류7,14,15, 올리고당 16, 천연 소분자 17,18, 및 생약 추출물 및 수식 19,20의 동정을 이끌었다.
여기에 설명된 두 가지 주요 polyQ C. elegans 모델 및 Astragalus membranaceus7로부터 분리된 다당류인 아스트라갈란에 대한 연구에 의해 예시된 바와 같은 잠재적 응용을 위한 관련 프로토콜이 기술되어 있다. C. elegans에서의 polyQ 응집 분석의 경우, 사용된 모델은 Q40:YFP 융합 단백질의 발현으로 인해 성인기에 도달했을 때 체벽 근육에 분산된 형광 펑타를 보여주는 트랜스제닉 균주 AM141입니다:YFP 융합 단백질, 노란색 형광 단백질(YFP)21,22에 융합된 40개의 잔기(polyQ40)의 폴리Q 관 . HA759 균주는 ASH 뉴런에서는 녹색 형광 단백질(GFP)과 Htn-Q150(인간 헌팅틴 유래 폴리Q 관(150개 잔기의 인간 헌팅틴 유래 폴리Q 관)을 모두 발현하지만 다른 뉴런에서는 약하게 발현하여 진행성 신경변성 및 ASH 세포 사멸 7,13을 초래함에 따라 뉴런 생존 및 화학회피 거동을 검사하는데 사용되었다. 치료 후보물질의 신경 보호 잠재력에 대한 포괄적인 요약은 상이한 분석으로부터의 결과를 통합함으로써 제공된다.

<table><tbody><tr><td>C. elegans 균주</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]<</td><td>em>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/strain/AM141</td></tr><tr><td>HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/strain/HA759</td></tr><tr><td>E. coli strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NA22</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/strain/NA22</td></tr><tr><td>OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://cgc.umn.edu/strain/OP50시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd.</td><td>EQ1001-500G</td><td></td></tr><tr><td>https://www.ekear.com 아가로스</td><td>Biowest</td><td>111860</td><td></td></tr><tr><td>부탄디온</td><td>시노팜 화학 시약 Co., Ltd.</td><td></td><td>80042427 https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0</td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>C8667</td><td>https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>알라딘 주식회사</td><td>G116203</td><td>https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html</td></tr><tr><td>펩톤</td><td>Guangdong HuanKai 미생물 과학 기술 Co., 주식 회사.</td><td>050170B</td><td>https://www.huankai.com/show/21074.html</td></tr><tr><td>아지드 나트륨</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd.</td><td>80115560</td><td>https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd.</td><td>10019718</td><td>https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6</td></tr><tr><td>차아염소산나트륨 용액</td><td>광저우 화학 시약 공장</td><td>7681-52-9</td><td>http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125</td></tr><tr><td>트립톤</td><td>옥소이드 Ltd.</td><td>LP0042B</td><td>https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Oxoid Ltd.</td><td>LP0021B</td><td>https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>384-well cell culture plate</td><td>Nest Biotechnology Co., Ltd.</td> (주)<td>761001</td><td>https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85</td></tr><tr><td>48웰 세포 배양 플레이트</td><td>Nest Biotechnology Co., Ltd.</td><td>748001</td><td>https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85</td></tr><tr><td>90mm 페트리 접시</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>F611003</td><td>https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003</td></tr><tr><td>오토클레이브</td><td>Panasonic</td><td>MLS-3781L-PC</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>ChongQing Optical Co., Ltd.</td><td>ZSA0745</td><td>http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64</td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.</td><td>Mshot MF31-LED</td><td></td></tr><tr><td>https://www.mshot.com/article/442.html High-content imaging system</td><td>Molecular Devices</td><td>ImageXpress</td><td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>GeneCompany</td><td>GENESPEED X1</td><td>https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html</td></tr><tr><td>현미경 디지털 카메라</td><td>광저우 마이크로 탄 광학적인 기술 Co., 주식 회사.</td><td>MS60</td><td>https://www.mshot.com/article/677.html</td></tr><tr><td>마이크로파</td><td>Midea Corp.</td><td>&nbsp; M1-211A</td><td>https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html</td></tr><tr><td>파라필름 M</td><td>시그마-알드리치</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product 셰이커</td><td>Zhicheng Inc.</td><td>ZWY-2102C</td><td>http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image acquisition and analysis software</td><td>Molecular Devices</td><td>MetaXpress</td><td>https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress</td></tr><tr><td>OriginPro</td><td>OriginLab Corp.</td><td>버전 9.8.5.204</td><td>1. 소프트웨어 소개: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. 레이더 차트 생성 지침: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. 레이더 차트 생성을 위한 비디오 자습서: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813</td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans는 polyglutamine-mediated neurotoxicity에 대한 생리 활성 화합물을 발견하기위한 모델 시스템으로서의

Caenorhabditis elegans as a Model System for Discovering Bioactive Compounds Against Polyglutamine-Mediated Neurotoxicity

연령과 관련된 병원성 단백질의 미스폴딩 및 응집은 여러 신경 퇴행성 질환에 책임이 있습니다. 예를 들어, 헌팅턴병(HD)은 주로 헌팅틴 단백질에서 확장된 글루타민 관을 인코딩하는 CAG 뉴클레오티드 반복에 의해 유발된다. 따라서, 폴리글루타민(polyQ) 응집의 억제 및, 특히 응집-관련 신경독성은 HD 및 다른 폴리Q 관련 상태의 예방을 위한 유용한 전략이다. 이 논문은 확립 된 polyQ 트랜스제닉 Caenorhabditis elegans 모델을 사용하여 HD 에 대한 테스트 화합물의 신경 보호 능력을 평가하기위한 일반화 된 실험 프로토콜을 소개합니다. AM141 균주는 polyQ::YFP 융합 단백질의 근육 특이적 발현으로 인해 성인 단계에서 그의 체벽에서 쉽게 관찰될 수 있는 분리된 형광 응집체의 연령 관련 표현형으로서 polyQ 응집 분석을 위해 선택된다. 대조적으로, ASH 뉴런에서 polyQ-expanded tracts의 강한 발현을 갖는 HA759 모델은 뉴런 사멸 및 화학 회피 거동을 검사하는데 사용된다. 표적 화합물의 신경 보호 능력을 종합적으로 평가하기 위해, 상기 시험 결과는 궁극적으로 직접 비교 및 직접 관찰의 방식으로 여러 표현형의 프로파일 링과 레이더 차트로 제시됩니다.

형질전환 폴리Q 균주 AM141은 그의 체벽 근육 세포 7,21에서 Q40::YFP 융합 단백질을 강하게 발현한다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 이 균주의 분리된 응집체 표현형은 본 문서에 기술된 자동화된 이미징 및 분석 프로토콜에 의해 확인될 수 있다. AM141 선충류에서 Q40::YFP 응집체의 양은 L1 단계에서 48 시간 후에 유의하게 증가하였다. 그러나, 이러한 증가 경향은 황기 처리에 의해 억제되었고(도 1B), 폴리Q 응집에 대한 황기의 보호 가능성을 입증하였다. 일반적으로 72 h 또는 96 h는 시험 샘플의 응집 방지 효과를 평가하기 위해 Q40::YFP 응집체를 계수하는 시점으로 편리하게 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, AM141 선충류의 형광 응집체는 자동화된 이미징 시스템에 의해 포획되었지만, 형광 현미경은 또한 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다7.
 C. elegans 균주 HA759는 감각 ASH 뉴런에서 GFP 마커 및 Htn-Q150을 모두 발현하여 이러한 뉴런11,13의 점진적 손실 및 기능 장애를 유발합니다. 선충류를 ASH 뉴런 생존력을 확인하기 위해 2% 아가로스 패드에 장착하고(도 2A), ASH 뉴런을 검출하기 위해 현미경으로 시각화하였다. 선충류의 머리 영역에서 양측 ASH 뉴런에서 GFP 형광의 손실은 ASH 뉴런 사멸을 나타낸다(도 2B). HA759 선충류에서 ASH 뉴런의 생존율은 15°C에서 3일 동안 배양한 후 대조군에서 &lt;40%이며, 7,20%이며, 이는 polyQ 매개 신경독성을 나타낸다. 따라서, 이러한 ASH 뉴런 생존 분석은 C. elegans 뉴런에 대한 시험 화합물의 효과, 예를 들어, 포리아 글리칸이 아닌 황기의 신경 보호 효과를 시각적으로 평가하는데 사용될 수 있다(도 2C).
행동 기능 장애는 polyQ 질환에서 주요 임상 증상이기 때문에, 많은 수의 HA759 선충류를 사용하는 화학 감각 회피 분석 (도 3A)은 polyQ 응집에 의해 매개되는 ASH 뉴런의 기능적 손실에 대한 시험 샘플의 효과를 조사하기 위해 단순화 된 테스트로 설계되었습니다. 도 3B에 나타난 바와 같이, 미처리 대조군에서 HA759 선충류의 회피지수는 ∼0.5였으며, 이는 이전에 보고된것과 유사한 14이었다. 흥미롭게도, 회피지수는 3일 동안 15°C에서 황기로 처리된 선충류에서 &gt;0.6으로 증가하였고(도 3B), 행동 장애에 대한 다당류의 신경 보호 효과를 입증하였다.
시험 화합물의 전반적인 신경 보호 능력을 평가하기 위해, 상기 개별 분석의 데이터를 통합하고 여러 표현형에 대한 레이더 차트로 제시할 수 있으며, 이는 직접 비교 및 직접 보기에 적합한 폴리Q 표현형의 통일된 특징이 된다. 도 4에 나타난 바와 같이, 황기 처리군에서의 삼각형의 면적은 대조군의 면적보다 크고, 다당류의 항-polyQ 효과를 나타낸다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63081/63081fig01.jpg"> 도 1: polyQ40 응집에 대한 황기의 효과 . (A) 20°C에서 96시간 동안 황기 유무에 관계없이 처리한 후 AM141 선충류의 대표적인 이미지. 형광 이미지 (왼쪽 패널)는 고함량 이미징 및 분석 시스템을 사용하여 384 웰 플레이트에서 획득되었으며 Q40 : : YFP 응집체 (오른쪽 패널)는 시스템에 의해 자동으로 식별되었습니다. 인셋은 polyQ 응집체를 보여주는 선충류 이미지의 확대 된 뷰입니다. 스케일 바 = 500 μm. (B) Q40::YFP 응집체의 정량화. AM141 선충류 중의 Q40::YFP 응집체의 수를 20°C에서 황기 유무에 관계없이 처리한 후 4일 동안 매 24h마다 고함량 이미징 시스템을 사용하여 모니터링하였다. 각 그룹에서 대략 100-150 선충류가 각 시점에서 집계에 대해 점수가 매겨졌다. 결과는 선충류당 평균 응집체 수를 기준으로 적합곡선으로 나타내었다. 약어: 폴리Q = 폴리글루타민; YFP = 황색 형광 단백질; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63081/63081fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63081/63081fig02.jpg"> 도 2: Htn-Q150 매개 ASH 뉴런 사멸에 대한 황기의 효과. (A) 아가로스 슬라이드 제제의 개략도. (b) 400x 배율을 이용한 ASH 뉴런 생존 및 사멸을 갖는 HA759 선충류의 대표적인 현미경 사진. 스케일 바 = 20 μm. HA759 선충류를 L1로부터 3일 동안 15°C에서 황기 유무에 관계없이 처리한 후 형광현미경을 이용하여 촬영하였다. (C) 폴리Q 매개 ASH 뉴런 사멸에 대한 황기의 보호 효과. 복령술, 복령의 다당류인 복령을 대조군으로 사용하였다. 데이터는 세 개 이상의 독립적인 실험을 대표±는 세 번의 반복실험의 SD를 의미한다. 통계적 분석은 대조군의 데이터를 황기 및 복령 글리칸 그룹의 데이터와 비교하기 위해 쌍을 이루지 않은 두 꼬리 t-검정을 사용하여 수행되었다. *p &lt; 0.05; ns = 유의하지 않음. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63081/63081fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63081/63081fig03.jpg"> 도 3: Htn-Q150-매개된 행동 기능장애에 대한 황기의 효과. (A) 회피 분석 플레이트의 모식도. (B) 회피 분석의 대표적인 결과. 회피 지수는 N 구역 내의 선충류와 플레이트 상의 선충류의 총 수의 비로서 정의되었다. 결과는 세 번의 독립적인 실험을 대표±는 세 번의 반복실험의 SD를 의미한다. 회피 지수의 통계적 분석은 짝을 이루지 않은, 두 꼬리 t-검정을 사용하여 수행되었다. **p &lt; 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63081/63081fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63081/63081fig04.jpg"> 그림 4: 아스트라갈란의 전반적인 신경 보호 능력. 세 가지 다른 분석의 데이터를 OriginPro 소프트웨어로 가져와 레이더 차트를 만들고, 이 차트는 polyQ에 의해 매개되는 여러 표현형에 대한 황기의 일반적인 효과를 프로파일링하기 위해 제시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63081/63081fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63081/Table%201%20Solution%20Recipes%20(1).xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서, 우리는 폴리글루타민 응집, 뉴런 사멸 및 화학 회피 거동뿐만 아니라 다중 표현형의 예시적인 통합을 포함하는 예쁜꼬마선충에서 시험 화합물의 신경 보호 활성을 평가하기 위한 프로토콜을 제시한다.

Caenorhabditis elegans는 Polyglutamine-mediated Neurotoxicity에 대한 생리 활성 화합물을 발견하기위한 모델 시스템으로서의

Age-related misfolding and aggregation of pathogenic proteins are responsible for several neurodegenerative diseases. For example, Huntington&#39;s ...

신경 퇴행성 및 행동 연구에서 강력한 동물 모델 인 C.elegans는 헌팅턴병 유사 모델을 사용하여 폴리 글루타민 신경 독성에 대한 독성 화합물을 효율적으로 스크리닝하고 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 서로 다른 C.elegans 모델에서 여러 표현형을 프로파일 링하고 통합하는 것입니다. 또한 실제로 C.elegans 모델이이 방법에 사용됩니다.그것은 다른 신경 퇴행성 지연 및 실제로 다른 지연에 대한 치료 후보의 스크리닝 및 조사에 크기를 제공합니다. C.elegans 성장에 사용되는 온도에주의를 기울이고 이름 발달의 올바른 단계에서 테스트를 수행하십시오. 절차를 시연하는 것은 Jiang Yiyi, Xioa Yue, Wang Qiangqiang, 3 명의 대학원생이 될 것입니다.AM141 선충류의 300-500 개의 동기화 된 L1 유충을 E.coli의 OP50 균주와 황기 밀리리터 당 5 밀리그램을 포함하는 500 마이크로 리터의 S 배지가있는 48 웰 플레이트의 각 웰로 옮기는 것으로 시작하십시오. 플레이트를 파라필름으로 밀봉하고 섭씨 20도에서 원하는 시간 간격으로 분당 120회 회전하여 배양합니다. 선충류를 멸균 된 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 옮기고 원심 분리로 M9 완충액으로 3 회 세척하여 나머지 OP50 세포를 제거했습니다.그런 다음 M9 버퍼에서 AM141 선충을 다시 일시 중단합니다. 이제 10-15 개의 선충류를 384 웰 플레이트의 각 웰로 옮기고 각 처리에 대해 10 개의 복제 웰을 설정하고 각 웰에 10 마이크로 리터의 200 밀리몰 나트륨 아 지드화물을 추가하여 선충류가 바닥에 정착되도록하여 마비시킵니다. 형광 이미지를 획득하기 위해 고함량 이미징 시스템에 플레이트를 놓습니다.이미지 수집 소프트웨어를 열고 텍스트 원고에 언급된 파라미터를 설정합니다. 검토 플레이트 데이터 창을 열고 이미지 분석을 위한 테스트 플레이트를 선택하여 이미지 데이터를 분석합니다. 테스트 웰을 두 번 클릭하여 이미지를 표시합니다.그런 다음 분석 방법으로 카운트 핵을 선택하고 설정 구성 버튼을 클릭합니다. FITC 채널에서 소스 이미지를 정의하고 표준 알고리즘을 선택합니다. 텍스트 원고에 설명 된대로 이미지 분석 매개 변수를 설정하고 테스트하여 분석 방법을 최적화하십시오.설정을 저장하고 모든 우물에서 분석을 실행하십시오. 각 웰에서 Q40:YFP 응집체의 총 수로 전체 핵을 내보냅니다. 각 웰의 선충류 수를 세고 각 그룹의 선충 당 평균 Q40 : YFP 응집체 수를 계산합니다.이어서, 억제지수를 계산한다. polyQ 신경 독성 분석을위한 선충류를 준비하기 위해, HA759 선충류의 300-500 개의 동기화 된 L1 유충을 E.coli의 OP50 균주와 황기 밀리리터 당 5 밀리그램을 포함하는 500 마이크로 리터의 S 배지를 사용하여 48 웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 플레이트를 밀봉한 후, 이전에 설명된 대로 M9 완충액에서 선충류를 배양, 수확 및 재현탁합니다.이제 100ml의 M9 버퍼에 2g의 아가로스를 추가하여 아가로스 패드에서 준비하고 전자레인지에서 용액을 거의 끓을 때까지 가열합니다. 0.5 밀리리터의 녹은 아가 로스를 2 밀리미터 두께의 유리판 두 조각 사이에 놓인 1mm 두께의 현미경 유리 슬라이드의 중앙에 분배하고 다른 슬라이드로 수직으로 덮습니다. 아가로오스가 식고 응고되면 상단 슬라이드를 부드럽게 제거합니다.아그로스 패드에 20 밀리몰 나트륨 아 지드 (azide atide) 한 방울을 첨가 한 다음 15-20 개의 HA759 선충류를 방울로 옮겨 고정화하여 ASH 뉴런 생존 분석을 시작하십시오. 선충류 위에 커버 슬립을 부드럽게 놓습니다. 이제 슬라이드를 디지털 카메라가 장착된 형광 현미경 아래에 두십시오.40x 대물 렌즈와 FITC 필터를 선택하여 선충류의 머리 영역에서 GFP 양성 ASH 뉴런을 검출합니다. 각 그룹에서 무작위로 50개 이상의 선충류를 선택하여 머리 영역에 GFP 표지 양측 ASH 뉴런이 있는 선충의 수를 계산한 다음 ASH 뉴런의 생존율을 계산합니다. 삼투압 회피 분석의 경우 중간에 8몰 글리세롤 라인을 생성하여 식품이 없는 NGM 플레이트를 정상 영역과 트랩 영역으로 나눕니다.그런 다음 글리세롤 라인에서 약 1cm 떨어진 곳에 200 밀리몰 나트륨 아 지드 라인을 펼쳐 글리세롤 장벽을 통과하는 선충류를 트랩 영역으로 마비시킵니다. 각각 약 200 개의 선충류를 각 그룹에 대해 3 개의 복제 플레이트의 정상 영역으로 옮깁니다. 그런 다음 트랩 영역에 1 % 부탄디온 방울을 추가하여 선충류를 유인합니다.페트리 접시의 뚜껑을 즉시 덮고 섭씨 23도에서 90 분 동안 배양하십시오. 현미경으로 두 구역의 선충류 수를 측정하고 회피 지수를 계산합니다. 트랜스제닉 polyQ 균주 AM141은 체벽 근육 세포에서 Q40:YFP 융합 단백질을 강력하게 발현하며, 이 자동 이미징 및 분석 프로토콜로 식별되며, 그 양은 보호 잠재력을 입증하는 황기 처리에 의해 억제되었습니다.선충류의 머리 영역에서 GFP 형광 및 양측 ASH 뉴런의 손실은 ASH 뉴런 사멸을 나타냅니다. 이 ASH 뉴런 생존 분석은 Caenorhabditis 우아함 뉴런에 대한 테스트 화합물의 신경 보호 효과를 시각적으로 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 화학 감각 회피 분석은 polyQ 응집에 의해 매개되는 ASH 뉴런의 기능 손실에 대한 효과적인 시험 샘플을 조사하기 위해 사용되었습니다.섭씨 15도에서 3 일 동안 복사뼈로 처리 한 HA759 선충류의 회피 지수는 0.6 이상으로 증가하여 행동 장애에 대한 다당류의 신경 보호 효과를 입증했습니다. 시험 화합물의 전반적인 신경 보호 능력을 평가하기 위해 개별 분석의 데이터를 통합하여 대조군보다 황기 치료 그룹의 삼각형 면적을 보여주는 레이더 차트로 제시하여 다당류의 항 폴리 Q 효과를 나타냅니다. 음식, 온도 및 습기가 C.elegans의 행동에 영향을 미칠 수 있음을 명심하십시오.

caenorhabditis-elegans-as-model-system-for-discovering-bioactive

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

유전자 변형을 사용하여 시금 β - 아밀로이드 독성 C. 엘레간스 모델

이 비디오는 선충의 체벽 근육 세포에서 polyQ 응집을 줄이고 응집 관련 단백질 독성을 개선하는 데 있어 신경 보호 테스트 화합물의 보호 가능성을 스크리닝하는 생체 내 방법을 설명합니다.

웜에서 화합물의 신경 보호 효과를 확인하기 위한 PolyQ 응집 분석

이 비디오에서는 polyQ-매개 신경독성으로 인한 Caenorhabditis elegans의 신경세포 생존에 대한 테스트 화합물 astragalan의 신경 보호 효과를 평가하는 방법을 설명합니다. 이 분석은 ASH 뉴런에서 GFP에 융합된 비정상적으로 확장된 polyQ 반복을 발현하는 Caenorhabditis elegans를 사용하여 테스트 화합물 처리 후 뉴런 생존을 측정합니다.

웜에서 PolyQ-Mediated Neurotoxicity에 대한 테스트 화합물의 효과를 연구하기 위한 분석

이 비디오는 형질전환 웜 모델에서 화학 회피 거동을 조사하기 위한 삼투압 회피 분석에 대해 설명합니다. 회피 행동은 고삼투압 장벽과 화학유인물질이 있는 플레이트에서 테스트됩니다. 뉴런의 기능적 상실을 가진 기생충은 화학유인물질에 끌려, 고삼투압 장벽을 넘어, 마취액 때문에 트랩 영역에서 마비된다.

삼투압 회피 분석을 사용한 형질전환 벌레의 화학회피 거동 조사

우리는 벌레에 amylopathies의 양상을 연구하는 방법을...

<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</emAmylopathy 연구에 대한&gt; 모델 시스템

양적 방법 확인 하 고 자동으로 꼬마 선 충의 phenotypic 프로 파일링 분석 하 여 화학 물질의 급성 독성 예측 개발 되었습니다. 이 프로토콜 384-잘 접시에 화학 물질과 웜 치료, 비디오, 캡처 및 독물학 관련된 고기를 계량 하는 방법을 설명 합니다.

꼬마 선 충 의 프로 파일링 Phenotypic 자동화 하 여 화학 독성의 예측에 대 한 높은 처리량 분석 결과

전립선성 감소는 노화의 특징입니다, 신경 퇴행성 질환의 발병을 촉진. 우리는 형광 기자에게 융합 된 폴리 글루타민 반복의 이종 발현을 통해 두 가지 다른 Caenorhabditis elegans 조직에서 프로테오스타시스를 정량적으로 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 프로테오스타증의 생체 내 유전 적 분석을 빠르게 허용합니다.

Caenorhabditis 예인단에서 조직 특정 전립선 성 감소를 정량화

여기에서, 우리는 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환의 세포 및 분자 기초를 모니터링하고 해부하기 위해 과활성화 이온 채널 유도 괴사 및 단백질 골재 유도 신경 독성을 포함하여 일부 다목적 선충 모델을 활용하여 널리 접근 할 수있는 방법론을 소개하고 설명합니다.

카노르하비티스 예르간에서 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환 모델링

여기에서, 선충류 예쁜꼬마선충에서의 단백질 응집 동역학의 분석을 위한 방법이 제시 된다. 연령 동기화 된 집단의 동물은 서로 다른 시점에서 이미지화되고 CellProfiler에서 반자동 포함 계수가 수행되고 AmyloFit의 수학적 모델에 적합합니다.

Caenorhabditis elegans에서 자동 포함 계수를 사용하여 생체 내에서 단백질 응집 동역학 모니터링

를 사용하여 화합물 Bioactivity위한 이점 Nanoinjection 및 화면에 대한 전기 생리학 분석 Drosophila melanogaster 거대 섬유 시스템

탐색하세요 Caenorhabditis elegans를 활용한 폴리글루타민 신경독성에 대한 신경보호 화합물 스크리닝 방법을. 다중 표현형 분석으로 헌팅턴 병 치료 후보 물질을 평가하고 신경세포 생존률과 회피 행동을 정량화하여 신경퇴행성 질환 연구에 활용하세요.

Caenorhabditis elegans는 Polyglutamine-mediated Neurotoxicity에 대한 생리 활성 화합물을 발견하기위한 모델 시스템으로서의

더 많은 동영상 탐색