Name: 使用比色皿型快速重复率荧光计测量 Colacium sp.附着阶段的光生理学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 了解如何使用快速重复率荧光计实时测量Colacium sp.附着阶段的光合作用活性。该方法可在自然条件下研究藻类与浮游动物相互作用的光生理学响应，为水生生态系统初级生产力研究提供重要技术支持。

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该项工作得到了日本滋贺县协同研究基金的资助 &#34;水环境健康保护中的水质与湖底环境研究&#34; 在日本环境省地区振兴补助金及环境研究与技术开发基金（编号：5-1607）的资助下。&#160;https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html。作者谨此感谢 Enago（www.enago.jp）对本文英文语言的审校。

1. 取样
<ol>
	<li>采集湖水&#160;通过桶从表面采集目标样本。 Colacium sp. 附着于 S. mucronata (图1A- C使用100 µm尼龙筛网过滤0.5-10 L湖水52. 
	注意： S. mucronata 常在浅水、富营养化、泥泞的水域中密集聚集，例如芦苇（Phragmites）区域。</li>
	<li>将浓缩样品储存于装有350 mL湖水的500 mL塑料瓶中，避光保存。</li>
	<li>在实验室中，将样品水倒入500 mL烧杯中，静置几分钟。</li>
	<li>通过孔径为0.2 µm的滤膜过滤湖水。</li>
	<li>拾取 S. mucronata 在光学显微镜下以100倍放大倍数使用移液器挑取个体，并根据Błędzki和Rybak的方法进行物种鉴定。53.</li>
	<li>将它们转移到置于玻璃载片上的一滴经0.2 µm滤膜过滤的湖水（FLW）中。 
	注意： S. mucronata 可能游向液面或附着在烧杯壁上。</li>
	<li>检查 S. mucronata 在光学显微镜下。</li>
	<li>洗涤 S. mucronata 使用FLW（3滴或更多）的个体，以防止其他生物体的污染（图2).</li>
	<li>保持 S. mucronata 在&#160;一个 原位 在40 µmol photon·m⁻²·s⁻¹光照条件下，于培养室中控制温度−2·s−1.</li>
</ol>
2. 作用与影响 S . mucronata 在基线荧光水平
<ol>
	<li>S. mucronata 培养
	<ol>
		<li>拾取 S. mucronata 在100倍光学显微镜下使用移液器挑选个体，并按照步骤1.8用FLW洗涤。</li>
		<li>使用电动气泵通过气石对自来水曝气至少1周。将300 mL曝气后的自来水倒入350 mL玻璃瓶中。</li>
		<li>喂养 小球藻 (1 mg C·L⁻¹−1）并在 40 µmol 光子·m⁻²·s⁻¹ 光照强度下于 20 °C 继续培养−2·s−1 在生长室中。</li>
		<li>大约14天后，在100倍光学显微镜下用移液器挑取5–30个个体，接种于300 mL洁净且充气的自来水中，以保持培养环境新鲜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立FRRf
	<ol>
		<li>启动 Act2Run 软件。</li>
		<li>点击 选项 标签并选择 Act2 FLC（白色LED） 在 运行模式 设置测量光LED的颜色。</li>
		<li>点击该数值 暗 在步骤 1 主窗口中荧光光曲线的设置，并输入30以设定暗期持续时间（图3A).</li>
		<li>点击LED组合 B，C，以及 D 关闭绿色和橙色LED图3C).</li>
		<li>点击该数值 Fets 和 音高 在……下方 周六，分别输入100和2，以设定饱和阶段闪光刺激的数量和间距图3D).</li>
		<li>点击该数值 Fets 和 音高 下 Rel，分别设置为40和60，以设定弛豫相中闪光序列的数量和间距（图3E).</li>
		<li>通过点击启动水套泵 在FLC期间 (图3F) 用于在测量过程中控制样品温度。</li>
		<li>点击以激活 Auto-LED 和 自动PMT (图3F).</li>
		<li>点击 同步 连接 FRRf-Act2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FRRf 测量
	<ol>
		<li>为了检测个体浮游动物对基线荧光的影响，准备成年个体 S. mucronata （体长400-650 µm）来自2.1.1-2.1.4步骤培养物，无任何附着生物。</li>
		<li>为避免肠道内容物产生荧光, 饥饿处理&#160;在20°C下对FLW中的个体处理至少90分钟。</li>
		<li>将 1.5 mL FLW 倒入比色皿中。分别取 0、1、5 和 10 S. mucronata 在光学显微镜下以100倍放大倍率使用移液器的个体。</li>
		<li>转移 S. mucronata 将样品转移至比色皿中，并加入FLW至总体积为2 mL。</li>
		<li>在低光照（1–10 µmol photon·m⁻²·s⁻¹）条件下驯化−2·s−1在测量FRRf之前，于20 °C下孵育15分钟。</li>
		<li>点击 Act2 运行 开始测量。重复测量步骤 &#62;每个样本重复3次。</li>
		<li>阅读 Fo 结果图中的数值图4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 底物生物对Chl-的影响 a 荧光
<ol>
	<li>Colacium sp. 培养
	<ol>
		<li>准备 FLW 和 AF-6 培养基54 用于培养（表2).</li>
		<li>收集 Colacium sp. 附着于 S. mucronata 如步骤1.1和1.2所述，并保持在 原位 生长箱中的温度</li>
		<li>拾取 Colacium 蜕皮后的头胸甲物种（图1D使用移液器在100倍光学显微镜下进行操作。按照步骤1.8用FLW清洗。</li>
		<li>无菌接种 Colacium sp. 和 AF-6 培养基在&#160;洁净台上的一个10 mL玻璃试管。</li>
		<li>在原位温度下培养，光照强度维持在 200 µmol photon·m⁻²·s⁻¹−2·s−1 在培养箱中培养。每天至少手动轻轻摇动玻璃管一次，以防止细胞沉降。 
		注意：在进行FRRf测量前，应使用显微镜检查菌落，以尽量降低菌落聚集带来的衰减效应。细胞聚集可能导致菌落密度过高，进而影响藻类的光生理特性。55.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FRRf 测量
	<ol>
		<li>为了研究个体浮游动物对叶绿素a的影响a 荧光来自 Colacium sp.，准备成虫 S. mucronata （体长400-650 µm）且无任何附生生物。</li>
		<li>为避免肠道内容物产生荧光, 饥饿处理&#160;在 FLW 中至少停留 90 分钟的个体</li>
		<li>设置一个比色皿型快速重复率荧光仪（FRRf）。</li>
		<li>倒入1.5 mL预培养的样品 Colacium sp. 加入比色皿中。分别转移 0、5、10 和 15 S. mucronata 将个体放入这些比色皿中，并加入2 µm的过滤培养基，使样品体积达到2 mL。</li>
		<li>在低光照（1–10 µmol photon·m⁻²·s⁻¹）条件下进行驯化−2·s−1在20 °C下孵育15分钟后，进行FRRf测量。 
		注意：测量过程中需将样品保持在孵育温度下</li>
		<li>点击 Act2 运行 开始测量。重复进行测量 &#62;每个样本重复3次。</li>
		<li>阅读 FO&#160;和 Fm 结果图中的数值（图4). 
		注意：检查 RσPSII 值 (表1），用于指示LED功率是否处于正确估算PSII参数的最佳范围内。当激活Auto-LED功能时，Act2run系统将自动调节LED功率以达到最佳状态 RσPSII 范围（0.042–0.064）。实验 RσPSII 截断值在之前的研究中被定义为0.03和0.0848.</li>
		<li>校正基线荧光22，使用孔径为0.2 µm的滤器过滤培养基，然后测定荧光强度。减去 FO&#160;基线样本的 FO 和 Fm 的 Colacium sp.，或修改 空白校正 值在 设置 在 选项 表。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Colacium sp.（附着阶段）的光生理学
<ol>
	<li>分离 S. mucronata 个体 Colacium 在光学显微镜下使用移液器对sp.进行操作。</li>
	<li>洗涤 S. mucronata 使用 FLW，如步骤 1.8 所述。</li>
	<li>转移 S. mucronata 加入100 mL FLW中。饥饿处理时，在黑暗条件下培养 原位 90 分钟内温度</li>
	<li>将1.5 mL FLW倒入比色皿中。</li>
	<li>转移约10 S. mucronata 个体 Colacium sp. 比色皿中。进行测量时，需超过100 Colacium 每2 mL需要一定数量的细胞。加入FLW将样品补足至2 mL。</li>
	<li>在低光照（1-10 µmol photon·m⁻²·s⁻¹）条件下进行驯化−2·s−1在 原位 温度下孵育15分钟。测定Chl-a 荧光检测同步骤 3.2.6-3.2.8。</li>
	<li>为了计数贴壁细胞的数量，在完成FRRf测量后，用戊二醛（终浓度2%）固定样品。在多个焦平面和位置拍摄图像 S. mucronata 在光学显微镜下。</li>
</ol>
5. Colacium sp.（浮游阶段）的光生理学
<ol>
	<li>培养样品 Colacium sp. 在 AF-6 培养基中于 原位 温度同步骤 3.1.1-3.1.5。</li>
	<li>对于固定相，取2 mL培养物 Colacium sp. 并倒入比色皿中。</li>
	<li>在低光照（1-10 µmol photon·m⁻²·s⁻¹）条件下驯化−2·s−1在 原位 温度下孵育15分钟。测定叶绿素-a 荧光检测同步骤 3.2.6-3.2.8。</li>
</ol>
6. 添加 Ca 和 Mn 对 Colacium sp. 光生理特性的影响
<ol>
	<li>附着阶段的影响
	<ol>
		<li>在光学显微镜下用移液器分离带有 Colacium sp. 的 S. mucronata 个体，并按照步骤 1.8 使用 FLW 清洗。</li>
		<li>将六个个体分别转移至含有 30 mL FLW 的 12 个玻璃烧杯中。确保每个烧杯中含有 &#62;100 个 Colacium sp. 细胞。</li>
		<li>向每个烧杯中加入 200 µmol·L−1 CaCl2·H2O（Ca 处理）、40 µmol·L−1 MnCl4（Mn 处理）或超纯水（对照）。将样品置于培养箱中，在 原位 温度下以 200 µmol 光子·m−2·s−1 光照培养。</li>
		<li>在 3 小时和 21 小时时，将所有个体及蜕下的外皮转移至含有 2 mL 培养液的比色皿中。</li>
		<li>为检测对光照增强的快速响应，点击Up以设置 8 个梯度激发光步骤，并输入 20（图 3A），将每步持续时间设为 20 秒。为将梯度激发光设为 0、11、25、44、68、101、144 和 200 µmol 光子·m−2·s−1，点击High E 和 Step Up，并将数值分别更改为 200 和 34（图 3B）。</li>
		<li>暗适应 15 分钟后，参照步骤 3.2.6–3.2.8 测定每个样品的叶绿素a 荧光。 
		注意：验证 RσPSII 和 RσPSII' 值是否处于最佳范围（0.03–0.08）48。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>浮游阶段的影响
	<ol>
		<li>按照步骤 3.1.1–3.1.5，在 AF-6 培养基中于 原位 温度下培养采集的 Colacium sp.。</li>
		<li>将培养的 Colacium sp. 转移至 FLW 中，并在 原位 温度下、光照强度低于 200 µmol 光子·m−2·s−1 的条件下驯化 3 天。</li>
		<li>将 1 mL 驯化后的样品转移至三个含有 10 mL FLW 的玻璃小瓶中。</li>
		<li>向小瓶中加入 200 µmol·L−1 CaCl2·H2O（Ca 处理）、40 µmol·L−1 MnCl3&#160;（Mn 处理）或超纯水（对照）。将样品置于培养箱中，在 原位 温度下以 200 µmol 光子·m−2·s−1 光照培养。</li>
		<li>在 3 小时和 21 小时时，参照步骤 3.2.6–3.2.8 测定每个样品的叶绿素a 荧光。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

本方案首次证明，在自然环境中附着阶段的Colacium sp. 的光生理特性与在AF-6培养基中浮游阶段的光生理特性具有可比性。此外，当饥饿处理的S. mucronata密度≤5 inds·mL−1时，其肠道内容物对基础状态及叶绿素a荧光无显著影响（图5 和 图6）。这些结果表明，在底物生物丰度较低的情况下，本方案可无需校正即可用于测量Colacium sp. 在附着阶段的光生理特性。然而，步骤3.2.1–3.2.8的结果显示，较高丰度的S. mucronata对Fv/Fm和NPQNSV有显著影响，但对FO和σPSII&#160;无显著影响（图4）。此处可能的原因是较高的...

叶绿素可变荧光是测量藻类光系统II（PSII）光生理学的有用工具。藻类通过改变其PSII光生理学来响应各种环境胁迫，例如过量光照和营养缺乏。快速重复频率荧光仪（FRRf）是测量PSII光生理学1,2以及估算初级生产力1,3,4的常用方法，可用于在广泛的时空尺度上监测浮游植物PSII光生理状态及初级生产力5,6,7。FRRf可同时测量PSII的吸收截面（σPSII）、反应中心浓度（[RCII]）、最大光化学效率（Fv/Fm）、有效光化学效率（Fq′/Fm′）以及非光化学淬灭（NPQNSV）（表1）。通常，Fv/Fm和Fq′/Fm′被定义为PSII活性8，而NPQNSV&#160;被定义为相对热耗散能量9。
重要的是，FRRf 的单次 turnover（ST）闪光可完全还原初级醌类电子受体 QA，但不会还原质体醌池。相反，脉冲振幅调制（PAM）荧光仪的多次周转（MT）闪光可同时还原两者。在识别可能的来源时，单周转（ST）方法相较于多次周转（MT）方法具有明显优势 非光化学淬灭NSV&#160;通过同时测量F的恢复动力学v/m, Fq′/Fm′, 非光化学淬灭NSV，以及 σPSII10迄今为止，已有多种类型的FRRf仪器实现商业化，例如潜水式、比色皿式和流通式。潜水式FRRf仪器能够 原位 海洋和湖泊中的测量，而比色皿型FRRf适用于小体积样品的测量。流动式FRRf通常用于连续测量表层水体中浮游植物的光生理特性。
随着PAM荧光仪（包括比色皿式）在广泛研究领域中的发展11，在藻类光生理学研究中，PAM荧光仪的应用仍比FRRf更为普遍12。例如，尽管这些仪器在样品室结构和比色皿容量上的差异较小，但比色皿式PAM已广泛应用于浮游植物13,14,15、底栖微藻16,17,18、冰藻19以及附生藻类20，而比色皿式FRRf主要应用于浮游植物21,22,23以及少数冰藻群落24,25。鉴于其有效性，比色皿式FRRf同样适用于底栖和附生藻类。因此，拓展其应用范围将有助于深入理解光系统II（PSII）的光生理特性，特别是对了解较少的附生藻类光生理学具有重要意义。
附生藻类受到的关注较少，仅有少数研究探讨了其光系统II的光生理学特性20,26，这很可能是因为它们在水生食物网中的作用较小27,28。然而，包括附生藻类在内的附生生物可能对浮游动物群落动态产生积极影响，例如提高繁殖率和存活率29,30，同时也可能带来负面影响，例如增加沉降速率29,31以及增强被视觉捕食者捕食的风险32,33,34,35,36。因此，探究控制浮游动物群落中附生生物动态的环境和生物因素至关重要。
在表生藻类中， Colacium Ehrenberg 1834（裸藻门）是一类常见的淡水藻类群32,37,38,39 包含不同的生命阶段，如附着的（图1A-D），非运动性的浮游（图1E，F，以及可运动的浮游阶段40,41在非运动性的浮游阶段，细胞以单细胞浮游形式、聚集体菌落或单层膜状菌落存在，并被黏液覆盖。42在附着阶段， Colacium sp. 利用细胞前端分泌的黏液37,39,41 附着于基质生物（基础生物体），特别是微型甲壳类动物41,43它们的生命周期还包括从蜕下的外骨骼或死亡的基底生物体上脱离，并利用鞭毛游动以寻找另一种底物生物。39浮游和附着阶段均能通过有丝分裂增加其种群数量40尽管它们的固着阶段被认为是一种用于获取资源（如光照）的进化性状44 和微量元素41,45,46，或作为一种分散策略27关于这些方面的实验研究证据仍然十分有限37,41,44 其关键附着机制在很大程度上尚不清楚。例如，Rosowski 和 Kugrens 预期 Colacium 从底物桡足类动物中获取锰（Mn）41，集中于外骨骼中47.
本文介绍了如何利用腔体型快速重复闪光叶绿素荧光仪（FRRf）测量浮游态藻类的光系统II（PSII）光生理特性，并将其应用于以附着在浮游动物上的Colacium sp. 细胞为对象的附着态藻类研究。我们使用配备三种发光二极管（LED）的Act2系统，其闪光激发光波长峰值分别为444 nm、512 nm和633 nm48。其中，444 nm（蓝光）对应叶绿素a（Chl-a）的吸收峰，512 nm（绿光）和633 nm（橙光）则分别对应藻红蛋白和藻蓝蛋白的吸收峰。荧光信号检测波长为682 nm，半峰宽30 nm。由于在自然环境中难以发现Colacium sp. 的浮游阶段，因此实验中采集的是其附着阶段的样本。在多种可能的基质生物中，Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776（枝角目，Daphniidae科；图1A、B、G）因其游泳速度缓慢、体型较大（400–650 µm）以及独特的悬挂在水面倒置行为，成为最易于操作的实验材料之一。因此，本实验方案以附着于S. mucronata上的Colacium sp. 作为Colacium–宿主系统的一个案例研究。为避免肠道内容物产生荧光干扰，实验前对S. mucronata进行了饥饿处理。已有研究表明，肠道内含物（摄食的藻类）的荧光信号在饥饿40分钟后可下降五倍49，因此我们预计90分钟的饥饿处理足以最大限度地减少肠道内容物荧光对FRRf测量结果的干扰，同时将营养缺乏等实验胁迫对Colacium sp. 的影响降至最低。此外，本方案还被用于阐明Colacium sp. 的附着机制，并探究钙（Ca）和锰（Mn）两种金属元素对浮游态和附着态藻类光生理特性的影响。钙在光合作用通路中具有多种关键作用50，而这两种金属元素均为构建PSII放氧复合体所必需51。由于钙和锰在甲壳类浮游动物的外壳中高度富集47，我们推测，若Colacium sp. 在附着阶段从S. mucronata获取这些元素，则其在浮游阶段的光生理特性可能对钙和锰的富集表现出更显著的响应。

<table><tbody><tr><td>Acrodisc 注射器滤器</td><td>Pall Corporation，美国密歇根州安娜堡</td><td></td><td>0.2 &amp;mu;微米孔径</td></tr><tr><td>Act2Run</td><td>CTG有限公司，英国韦斯特莫尔西</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>和光</td><td>023-08711</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>和光</td><td>031-25031</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>CaCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>和光</td><td>036-00382</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>和光</td><td>036-05522</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>和光</td><td>036-03682</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>浓缩小球藻</td><td>日本东京 Recenttec</td><td></td><td>20 mg C&amp;middot;mL&lt;sup&gt;&amp;minus;&lt;/sup&gt;&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt; ；4℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>FastOcean Act2</td><td>CTG有限公司，英国韦斯特莫尔西</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fe-柠檬酸盐</td><td>和光</td><td>093-00952</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>和光</td><td>091-00872</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>HCLP-880PF</td><td>日本医疗与化学仪器公司&lt;br/&gt; &amp;nbsp;株式会社，日本大阪</td><td></td><td>使用LED灯泡</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;高倍镜油镜（HPO）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>和光</td><td>160-04292</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;光系统II&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako</td><td>167-04241</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako</td><td>137-00402</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako</td><td>139-00722</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>和光</td><td>343-01861</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>和光</td><td>196-02472</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>NaNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>和光</td><td>191-02542</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;否&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Wako</td><td>015-03231</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>浮游生物计数器</td><td>Matsunami Glass，大阪，日本</td><td>S6300</td><td></td></tr><tr><td>Pylex 试管</td><td>CTG有限公司，英国韦斯特莫尔西</td><td></td><td>带边缘，16 × 100 mm</td></tr><tr><td>维生素B&lt;sub&gt;1&lt;/sub&gt;</td><td>和光</td><td>203-00851</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>维生素 B&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;</td><td>和光</td><td>226-00343</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>维生素B&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Wako</td><td>165-05401</td><td>AF-6 培养基</td></tr><tr><td>ZnSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>和光</td><td>264-00402</td><td>AF-6 培养基</td></tr></tbody></table>

使用比色皿型快速重复速率荧光仪测量附着阶段colacium sp. 的光生理特性

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

快速重复率荧光仪（FRRf）是一种用于测量光系统II（PSII）光生理学和初级生产力的有效方法。尽管FRRf可用于测量多种真核藻类和蓝细菌的PSII吸收截面（σPSII）、最大光化学效率（Fv/Fm）、有效光化学效率（Fq′/Fm′）以及非光化学淬灭（NPQNSV），但迄今为止几乎所有FRRf研究均集中于浮游植物。本文所述方案介绍如何利用比色皿型FRRf测量附生藻类Colacium sp.&#160;Ehrenberg 1834（裸藻门）在附着阶段（附着于浮游动物）的PSII光生理学特性。首先，我们估算了基质浮游动物Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776（枝角目，溞科）对浮游态Colacium sp.的基线荧光以及σPSII、Fv/Fm、Fq′/Fm′和NPQNSV的影响。为验证该方法的有效性，我们记录了附着在S. mucronata上的Colacium sp.的光生理学参数，并将其与浮游阶段的结果进行比较。代表性结果展示了本方案如何确定钙（Ca）和锰（Mn）对Colacium sp.光生理学的影响，并识别Mn富集在附着态与浮游态之间产生的不同效应。最后，我们讨论了该方案在其他周丛藻类研究中的适用性。

基线荧光强度无显著影响（图5）或 Chl-a 荧光图6）由 S. mucronata 最多5个个体（inds.）/mL−1。然而， Fv/m 和 NPQNSV 受到显著影响 S. mucronata 为 7.5 个个体·mL⁻¹−1因此，为了测量光生理学的 纤鞭藻属 sp. 在附着阶段，我们选择了 S. mucronata 负担较重的 纤鞭藻属 sp. 以达到足够的 纤鞭藻属 sp. 丰度（&gt;50 个细胞·mL⁻¹−1以及较少的数量 S. mucronata （≤5 个·mL⁻¹）−1)放入比色皿中。
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快速重复率荧光仪（FRRf）是测量光系统II光生理学和初级生产力的有效方法。本文介绍了一种利用比色皿式FRRf测定附生于浮游动物基质上的附生藻类Colacium sp.的光系统II光生理学的实验方案。

使用比色皿型快速重复速率荧光仪测量附着阶段Colacium sp. 的光生理特性

快速重复率荧光仪（FRRf）是一种用于测量光系统II（PSII）光生理学和初级生产力的有效方法。尽管FRRf……

本方案用于测量附着在浮游生物上的藻类的光合作用活性，其状态与自然界中完全相同。该技术的主要优势在于，可在不干扰样品的情况下实时测定光生理参数。为考察浮游动物个体对基础荧光的影响，需从培养物中选取成年个体 Scapholeberis mucronata，且其体表不得有任何附生生物。现在将个体置于 FLW 中，在 20 摄氏度下饥饿处理至少 90 分钟，以避免肠道内容物产生荧光。将 1.5 毫升 FWL 倒入比色皿中。挑选所需数量的 s。在100倍光学显微镜下，使用移液器挑选 mucronata 个体并转移至比色皿中。加入 FLW 使样品体积达到 2 毫升，并在 20 摄氏度低光条件下平衡 15 分钟，然后进行快速重复率荧光仪测量。随后点击“act to run”开始测量，每份样品重复测量至少三次。从所得图谱中读取 F0 值。在光学显微镜下以 100 倍放大倍数，用移液器挑取具有蜕皮甲壳的钟虫（Colacium）物种，并用 FLW 清洗。在超净工作台上，将钟虫（Colacium）物种无菌接种于 10 毫升玻璃试管中的 AF-6 培养基中。在培养箱中将培养物保持在NC2温度下，并每天至少手动轻轻摇动玻璃管一次，以防止细胞沉降。为了研究枝角类个体对胶膜藻属物种叶绿素a荧光的影响，应使用未附着任何其他生物的成年S. mucronata。为避免肠道内容物产生荧光，需将个体置于 FLW 中饥饿至少 90 分钟。设置一个杯型快速重复速率荧光仪。然后将 1.5 毫升预培养的胶藻属物种的子样品倒入荧光杯中。然后将所需数量的 s. mucronata 个体转移至这些比色皿中，并用过滤后的培养基将样品体积补足至 2 毫升。在进行快速重复率荧光仪测量前，于 20 摄氏度的弱光条件下使个体适应 15 分钟。点击“act to run”开始测量，每份样品重复测量三次以上。从所得曲线图中读取F0和FM值。为校正基线荧光，使用0.2微米孔径滤器过滤培养基，然后测量荧光值。从空肠菌物种的 F0 和 FM 中减去基线样品的 F0，或在选项选项卡的设置中修改空白校正值。在光学显微镜下使用移液管分离带有空肠菌物种的 s. mucronata 个体。然后使用 FLW 清洗 s. mucronata。转移 s.将mucronata放入100毫升FLW中，在NC2温度下避光培养90分钟以进行饥饿处理。取1.5毫升FLW加入比色皿中。转移约十个s。将带有胶鞘藻属（Colacium）物种的纤细弓形藻（mucronata）个体放入比色皿中，并加入FLW培养基，使样品总体积达到2毫升。在N2C温度下用弱光平衡15分钟，然后按照文稿中所述方法测定叶绿素a荧光。为统计附着细胞数量，在完成快速重复频率叶绿素荧光仪（fast repetition rate fluorometer）测定后，用2%戊二醛固定样品。然后在光学

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科研

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生物学

使用比色皿型快速重复率荧光计测量 Colacium sp.附着阶段的光生理学

基于液滴的微流控平台有望用于高通量实验，因其能够以千赫兹速率低成本生成皮升级、自成隔室的微小反应容器。通过与快速、灵敏且高分辨率的荧光光谱方法相结合，可高效地提取、利用并整合这些系统中产生的大量信息。...

微流控液滴平台的荧光检测方法

荧光共振能量转移（FRET）显微技术是一种利用多种生物传感器作为报告分子，实时监测活细胞内信号事件的强有力方法。本文介绍如何使用市售组件构建定制化的落射荧光FRET成像系统，以及如何利用该系统开展FRET实验。...

使用单分子生物传感器通过FRET显微镜实时监测活细胞中的信号事件

本视频展示了利用荧光涨落光谱法（FFS）研究蛋白质同源寡聚化的技术。在使用FFS研究蛋白质寡聚化时，样品中带有荧光标记的蛋白质会通过某种试剂诱导形成二聚体。利用共聚焦显微镜，当蛋白质分子进出微小的观测体积时，通过分析荧光分子亮度涨落的变化，可确定蛋白质的寡聚状态。...

荧光涨落光谱法研究蛋白质同源寡聚化

来源：Kulkarni, M. et al. 小鼠视网膜视锥光感受器轴突末梢中 Ca2+ 动态的成像研究。 J. Vis. Exp.

双光子显微镜监测小鼠视网膜视锥光感受器中的钙动力学

细胞内 Ca2+ 动态变化在精子生理学中具有重要意义，而 Ca2+ 敏感染料则为研究这些变化提供了多功能工具。通过群体实验（荧光测定法和停流荧光测定法）和单细胞实验（流式细胞术和单细胞成像），可用于追踪人精子细胞中时空性的 [Ca2+]...

使用四种技术测量人类精子细胞内 Ca2+ 的变化：常规荧光测定法、停流荧光测定法、流式细胞术和单细胞成像

目前，大多数可用的钙离子指示剂用于定量培养的平滑肌细胞中胞质钙瞬变，以此作为肌浆网释放钙离子的间接测量方法。本方案描述了一种基于FRET的特异性指示剂的使用，该指示剂可直接测量肌浆网腔内的钙信号。...

使用基于FRET的共聚焦成像技术测量培养的平滑肌细胞肌浆网内的钙离子波动

在心脏中，分子事件协调着器官的电活动和收缩功能。本文介绍了一系列局部场荧光显微技术，可用于在完整心脏中记录细胞水平的变量。明确调控心脏功能的机制，对于理解心脏在病理状态下的工作方式至关重要。...

局部场荧光显微技术：在完整心脏中成像细胞信号

本文介绍了利用高速模块化光度测量系统，对诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的动作电位进行光学采集与表征的方法。...

人诱导多能干细胞来源心肌细胞中的单细胞光学动作电位测量

本文介绍了一种利用宽场荧光显微镜对基于移动单分子荧光共振能量转移（smFRET）探针进行时空分析的方法。新开发的软件工具包能够确定运动探针的smFRET时间轨迹，包括随时间变化的准确FRET效率和分子位置。...

自动化二维时空分析可移动单分子FRET探针

本实验方案详细描述了基于光谱分析的红藻藻胆蛋白变化的自发荧光成像与评估步骤。该方法无需标记且对样品无损伤，适用于仅能获取少量材料、细胞在实验室条件下生长缓慢或完全无法生长时，对细胞适应极端生境能力的评估。...

利用自发荧光成像评估红藻生理状态

了解如何使用快速重复率荧光计实时测量Colacium sp.附着阶段的光合作用活性。该方法可在自然条件下研究藻类与浮游动物相互作用的光生理学响应，为水生生态系统初级生产力研究提供重要技术支持。

使用比色皿型快速重复速率荧光仪测量附着阶段Colacium sp. 的光生理特性

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