Высокопроизводительная конфокальная визуализация квантовых точек-конъюгированных пиковых тримеров SARS-CoV-2 для отслеживания связывания и эндоцитоза в клетках HEK293T

Мы создали технологию платформы для SARS COVID 2, которая может быть применима к другим вирусам с опосредованным Spike распознаванием клеток и проникновением в качестве первого шага в клеточной вирусной инфекции. Квантовые точки яркие, стабильные, и их поверхность может быть функционализирована для различных клеточных применений. Используя этот метод, мы можем визуализировать и измерить интернализацию Спайка в клетках.

Приготовить 0,1% BSA. Добавьте 130 микролитров 7,5% BSA к 10 миллилитрам носителей изображений в смеси. Для последовательного разбавления от 6,1 до трех и трех частей добавьте 14,26 микролитров QD Spike к 285,74 микролитрам 0,1% BSA, чтобы получить самую высокую концентрацию 20 наномолей.

Затем добавьте 100 микролитров 20 наномолей или QD Spike к 200 микролитрам 0,1% BSA, чтобы сделать второй бред 6,67 наномолей QD Spike. Удалите все отработанные среды из каждой скважины с помощью многоканального аспиратора, промыть один раз многоканальной пипеткой со 100 микролитрами среды визуализации на лунку, затем аспирировать 100 микролитров носителя изображения. Добавьте обратно 50 микролитров раствора QD Spike на лунку и инкубируйте пластину в течение трех часов в увлажненном инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом.

Надев защитное снаряжение, подготовьте среду визуализации 4% PFA и 0,1% PSA внутри стерильного шкафа биобезопасности, аспирируйте 50 микролитров QD Spike из каждой скважины и добавьте 100 микролитров 4% PFA на скважину с помощью автоматизированной многоканальной пипетки, чтобы избежать сушки скважин. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре, затем трижды промыть PBS, приготовить темно-красный ядерный краситель, разбавив пятимиллиметровый раствор при одном до 1000 в PBS, аспирировать PBS и добавить обратно 50 микролитров разбавленного ядерного красителя на лунку. Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, затем трижды промывайте PBS, визуализируйте пластину или запечатывайте ее с помощью герметика пластин для последующего получения изображения.

Храните пластину при четырех градусах Цельсия. Запустите программное обеспечение для платформы обработки изображений. После регистрации в платформе визуализации создайте новый протокол сбора, выбрав тип пластины в качестве 96-настенной прозрачной нижней пластины изображения, выберите оптический режим, который стал фокусным, а увеличение в 40 раз - погружением в воду, выберите биннинг как один.

Выберите режим для цифровых контрастов лиц, таких как высокая контрастность, чтобы создать четко определенные тела клеток. Сделайте снимок, чтобы убедиться, что этот заголовок подходит, как показано в окне изображения, выберите подходящий канал C для использования с линией ячейки ACE2-GFP, чтобы визуализировать трафик ACE2 внутри ячейки. Чтобы создать пользовательский канал QD, выберите выпадающее меню треугольника и выберите возбуждение в диапазоне излучения 405 нанометров в диапазоне 608 нанометров, выберите скважину с надежным цитоплазматическим сигналом QD, чтобы установить время экспозиции, мощность лазера и положение высоты Z.

Проверьте, создает ли высота по умолчанию изображение ячеек в нужной фокальной плоскости. Положение Z будет ниже для эндоцитозной пункты, чем положение Z для плазматической мембраны. Выберите время экспозиции, обычно от 100 до 300 миллисекунд, которое создает яркое изображение с уровнями серого, по крайней мере, в три раза превышающими фоновый сигнал.

При 20 наномоле уровни серого должны составлять примерно 6 000 атомных единиц с временем экспозиции 200 миллисекунд и мощностью лазера 80%. Проверьте уровни серого, щелкнув правой кнопкой мыши на изображении, полученном с функцией снимка в каждом канале и выбрав интенсивность шоу, затем щелкните левой кнопкой мыши на интересующем объекте или фоне, чтобы просмотреть уровень серого для этого пикселя, отрегулируйте мощность лазера для точной настройки интенсивности интересующих объектов. Сохраните протокол сбора, переключитесь на запуск эксперимента и введите имя пластины, запустите эксперимент.

Транслокация как QD, так и ACE2 была визуализирована с использованием флуоресцентной микроскопии и ACE2-GFP экспрессирующей клеточной линии. Сегментация изображения и последующий анализ выполнялись для извлечения соответствующих параметров, таких как количество пятен. Во-первых, ядра были сегментированы из канала ядерного маркера для создания популяции ROI.

Затем область ROI, очерчивающая ячейку с сегментированием с использованием канала ACE2-GFP. Наконец, точки всплеска QD 608 были сегментированы из области ROI клеток, интернализованные сигналы QD и ACE2 показали сильную колокализацию. Эксперимент по концентрационному ответу с шестью различными концентрациями QD Spike проводился в клетках HEK 293T.

При определении оптических концентраций QD, QDS можно использовать до 2,22 наномолей, однако рекомендуется использовать концентрации 10 наномолей или выше для обеспечения надежного отклика. Во время конъюгации с QD может произойти агрегация белка. Агрегаты были обнаружены в растворе QD в виде ярких слипшихся осадков и клеток HEK 293T, QD инкубировали с нейтрализованными антителами, начиная с 30 микрограммов на микролитр перед добавлением к клеткам, эти антитела блокировали интернализацию связывания и вызывали снижение количества пятен по сравнению с клетками, обработанными только QD.

Это эссе также может быть использовано для высокопроизводительного скрининга, проведения оценки нейтрализующих антител для выявления каламбурных противовирусных препаратов к блоку вирусного проникновения и адаптировано для изучения вновь возникающих вариантов.