Trapianto di neuroni GABAergici derivati da cellule staminali umane nell'ippocampo di topo postnatale precoce per mitigare i disturbi dello sviluppo neurologico
11 novembre 2022
Il trapianto di neuroni GABAergici derivati da cellule staminali pluripotenti umane generati dalla programmazione neuronale potrebbe essere un potenziale approccio terapeutico per i disturbi dello sviluppo neurologico. Questo protocollo descrive la generazione e il trapianto di precursori neuronali GABAergici derivati da cellule staminali umane nel cervello di topi neonatali, consentendo l'indagine a lungo termine dei neuroni innestati e la valutazione del loro potenziale terapeutico.
Questo approccio consente di studiare l'identità cellulare, l'integrazione e la funzionalità degli interneuroni trapiantati per un tempo prolungato nello sviluppo di cervelli sani e malati. Il protocollo descrive una generazione rapida e altamente efficiente di interneuroni GABAergici derivati da cellule staminali umane come precursori che sopravvivono e maturano nell'ippocampo di topi ingenui e transgenici. Questo approccio ci aiuta a valutare il potenziale terapeutico dell'uso della terapia cellulare nei disturbi dello sviluppo in cui gli interneuroni sono compromessi.
Per iniziare, rimuovere il terreno di coltura cellulare dai precursori dell'interneurone di origine umana e risciacquare accuratamente con DPBS senza calcio e magnesio. Aggiungere 400 microlitri della soluzione di distacco cellulare a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti. Incubare per due o tre minuti a 37 gradi Celsius nell'incubatore fino a quando il bordo delle cellule inizia a sembrare lucido.
Quindi, aggiungere 600 microlitri di terreno N2 fresco a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti per fermare la soluzione di distacco della cella e staccare meccanicamente le celle utilizzando una pipetta per ottenere una sospensione a cella singola. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di plastica e centrifugare a 180 G per quattro minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante utilizzando un sistema a vuoto e risospendere il pellet nel mezzo di trapianto.
Contare le celle totali nella sospensione utilizzando una camera di conteggio e un contatore di conteggio e regolare il volume a una concentrazione finale di 100.000 cellule per microlitro. Tenere la sospensione cellulare in un tubo chiuso sul ghiaccio fino al trapianto per un massimo di quattro ore. Immediatamente dopo l'anestesia, posizionare il cucciolo su un tessuto bagnato sulla superficie del ghiaccio bagnato per tre minuti fino a quando gli arti superiori diventano biancastri.
Risospendere le celle con cautela con la pipetta e caricare la siringa con la sospensione cellulare. Posiziona il cucciolo posizionandolo sul telaio stereotassico e usando le barre auricolari nella direzione opposta. Quindi, pulire la superficie della pelle usando un tessuto molle imbevuto di etanolo.
Identificare lambda e impostare le coordinate su zero sulla console di visualizzazione digitale dello strumento stereotassico. Dopo aver spostato la siringa di Hamilton alle coordinate desiderate, utilizzare un ago da insulina piegato a 90 gradi per penetrare nel cranio, creando un piccolo foro. Quindi, portare la siringa di Hamilton verso il basso fino a quando l'ago attraversa il cranio e azzerare la coordinata dorsoventrale.
Abbassare l'ago fino a raggiungere le coordinate dorsoventrali desiderate. Ritrarre lentamente l'ago una volta iniettate le cellule staminali. Termina la procedura riscaldando il cucciolo con le mani fino a quando non inizia a muoversi prima di restituirlo alla madre.
Nessuna reazione immunitaria o infiammazione locale contro le cellule trapiantate è stata riscontrata né al giorno postnatale 14 né due mesi dopo il trapianto, come valutato dall'assenza di microglia reattiva identificata utilizzando Iba1, CD68 e galectina-3. L'estensione dell'astrogliosi è determinata dalla proteina acida fibrillare gliale e dalle citochine infiammatorie, come l'interleuchina-1, e dall'assenza di linfociti citotossici. Nei topi knock-out Cntnap2, le cellule simili a interneuroni derivate da cellule staminali umane sono sopravvissute fino a nove mesi dopo il trapianto e sono state localizzate nel sito di iniezione.
Tuttavia, erano anche dispersi attraverso l'ippocampo omolaterale e persino controlaterale, come osservato nei topi wild-type. Il protocollo richiede pratica per garantire la minima interruzione e compressione del cervello, oltre a mantenere un buon equilibrio tra la velocità della procedura e la precisione delle coordinate. Questo protocollo è compatibile con una serie di tecniche, come studi di connettività o letture funzionali come l'elettrofisiologia o studi comportamentali, a seconda della ricerca, domanda di interesse.
Panoramica
Questo studio analizza il trapianto di neuroni GABAergici derivati da cellule staminali pluripotenti umane per esplorarne il potenziale impiego terapeutico nei disturbi neurosviluppali. Utilizzando topi neonati come modello, il protocollo consente la valutazione a lungo termine dell'integrazione e della funzionalità dei neuroni trapiantati sia in cervelli sani che geneticamente modificati.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Terapia cellulare
- Ricerca sulle cellule staminali
Sfondo
- Gli interneuroni GABAergici svolgono un ruolo cruciale nei circuiti neuronali e sono spesso compromessi nei disturbi dello sviluppo neurologico.
- La tecnologia delle cellule staminali pluripotenti umane consente la generazione di specifici tipi neuronali.
- Questo approccio potrebbe fornire informazioni sui meccanismi di integrazione cellulare all'interno del cervello.
- Studi precedenti hanno mostrato risultati promettenti nell'uso di neuroni derivati da cellule staminali per terapie rigenerative.
Scopo dello studio
- Generare e trapiantare precursori simili a interneuroni GABAergici derivati da cellule staminali umane.
- Valutare la loro integrazione e funzionalità nei cervelli di topi neonati.
- Studiare il potenziale terapeutico di questi neuroni nel trattare deficit causati da disturbi dello sviluppo neurologico.
Metodi Utilizzati
- Lo studio impiega un protocollo di trapianto in topi neonati.
- È stato utilizzato un tipo di precursore neuronale derivato da cellule staminali umane per il trapianto.
- Sono descritte in dettaglio le tecniche di preparazione cellulare e di trapianto, che consentono un intervento chirurgico accurato.
- La salute e l'integrazione dei neuroni trapiantati sono state monitorate per diversi mesi dopo il trapianto.
Risultati principali
- I neuroni trapiantati sono sopravvissuti e maturati sia nei topi di tipo selvaggio che in quelli geneticamente modificati.
- L'analisi post-trapianto non ha evidenziato alcuna risposta immunitaria significativa né infiammazione associata agli innesti.
- I neuroni sono stati ritrovati localizzati nel sito di iniezione e dispersi attraverso l'ippocampo, dimostrando un'integrazione nel tessuto dell'ospite.
- La sopravvivenza delle cellule innestate è stata mantenuta fino a nove mesi, sottolineando la loro vitalità a lungo termine.
Conclusioni
- Questo studio dimostra la fattibilità e l'efficacia del trapianto di neuroni GABAergici derivati da cellule staminali come potenziale trattamento per i disturbi dello sviluppo neurologico.
- Evidenzia l'importanza dell'integrazione neuronale per comprendere i meccanismi cellulari alla base di varie patologie cerebrali.
- I risultati sostengono l'utilizzo di questo approccio in ulteriori ricerche mirate alla terapia cellulare per condizioni neurologiche.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il trapianto di interneuroni GABAergici derivati da cellule staminali umane nell'ippocampo di topi neonati fornisce una piattaforma solida per valutare strategie di terapia cellulare rivolte a disturbi neurosviluppali. Questo approccio consente una valutazione a lungo termine dell'integrazione cellulare, della sopravvivenza e dell'impatto funzionale sia in modelli preclinici sani che in modelli rilevanti per le malattie. Il protocollo offre un grado predittivo affidabile nei test delle ipotesi terapeutiche e orienta le decisioni di avanzamento con valutazione del rischio per interventi basati sugli interneuroni.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi delle ipotesi di sostituzione degli interneuroni in circuiti neurali rilevanti per la malattia.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica chiarificando l'integrazione e la maturazione delle cellule trapiantate.
- Facilita la validazione funzionale degli obiettivi per strategie terapeutiche basate sugli interneuroni.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sistemi validati di interneuroni di origine umana per saggi funzionali e di connettività successivi.
- Consente flussi di lavoro riproducibili di trapianto e integrazione per una valutazione quantitativa.
- Permette la standardizzazione dei saggi per confronti tra studi e tra modelli.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per la patologia di displasia corticale ed epilessia, garantendo continuità traslazionale.
- Consente il monitoraggio longitudinale della sopravvivenza cellulare, della dispersione e dell'integrazione funzionale in vivo.
- Permette un avanzamento graduale, proporzionato ai rischi, dalla fase di scoperta alla validazione preclinica di terapie cellulari.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di trapianto collega la fase iniziale della scoperta, la validazione del bersaglio e la ricerca preclinica, consentendo una valutazione diretta dell'integrazione di interneuroni umani in modelli murini di disturbi dello sviluppo neurologico.
- Biologia della Scoperta Fornisce una piattaforma per la verifica di ipotesi sulla funzione degli interneuroni e sull'integrazione nei circuiti neurali.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili per la valutazione della sopravvivenza cellulare e della risposta dell'ospite.
- Analitica: Consente la misurazione dell'identità cellulare, della dispersione e dell'assenza di risposta immunitaria mediante marcatori consolidati.
- Ricerca traslazionale Collega la differenziazione in vitro alla valutazione funzionale in vivo in sistemi pertinenti alla malattia.
- Riutilizzo aziendale: Offre un flusso di lavoro scalabile e adattabile per diversi programmi terapeutici basati sugli interneuroni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nelle ipotesi terapeutiche basate sugli interneuroni e riduce l'ambiguità meccanicistica.
- Valore operativo: Standardizza la valutazione del trapianto e dell'integrazione per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione e l'allocazione del capitale per portafogli di terapie cellulari rivolte ai disturbi neurosviluppativi.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio delle strategie di sostituzione degli interneuroni nelle fasi di scoperta e preclinica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella differenziazione delle cellule staminali, chirurgia stereotassica e neurobiologia in vivo.
- Necessita l'accesso a piattaforme per la coltura cellulare, strumentazione per il trapianto e analisi immunohistochimiche.
- Richiede una standardizzazione intersettore della preparazione cellulare, delle coordinate di trapianto e della valutazione post-trapianto.
- Adattabile a diversi modelli murini e compatibile con letture funzionali, di connettività e comportamentali.
- La precisione e l'esperienza sono fondamentali per ridurre al minimo il danno cerebrale e garantire risultati riproducibili.
