Name: Preparo de Matrizes 3D Descelularizadas de Músculo Esquelético de Camundongos Fetais para Cultura Celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprenda a preparar matrizes descelularizadas de músculo esquelético fetal de camundongo para cultura de células C2C12. Este método permite estudar miopatias congênitas e interações celulares in vitro.

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Este trabalho foi financiado pela Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; contrato nº 23049), pelo projeto MATRIHEALTH e pela unidade cE3c UIDB/00329/2020. Agradecemos ao nosso doador Henrique Meirelles que optou por apoiar o Projeto MATRIHEALTH. Este trabalho beneficiou das infraestruturas do Centro de Microscopia da Faculdade de Ciências, um nó da Plataforma Portuguesa de BioImagem (referência PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), e agradecemos a Luís Marques pela sua assistência na aquisição e processamento de imagens. Finalmente, agradecemos a Marta Palma pelo apoio técnico e à nossa equipa de investigação pelas generosas contribuições.

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<li>Nunes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+fetal+muscle+development+and+JAK-STAT+activation+mark+disease+onset+and+progression+in+a+mouse+model+for+merosin-deficient+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).</li>
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<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization processes.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+skeletal+muscle%3A+A+versatile+biomaterial+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Biomaterials. 283, 121436(2022).</li>
<li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparable+decellularization+of+fetal+and+adult+cardiac+tissue+explants+as+3D-like+platforms+for+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e56924(2019).</li>
<li>Silva, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+scaffolds+of+fetal+decellularized+hearts+exhibit+enhanced+potential+to+support+cardiac+cells+in+comparison+to+the+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult.</a> Biomaterials. 104, 52-64 (2016).</li>
<li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).</li>
<li>Burattini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2C12+murine+myoblasts+as+a+model+of+skeletal+muscle+development%3A+morpho-functional+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization.</a> European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).</li>
<li>Murphy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caesarean+section+and+fostering%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Caesarean section and fostering.</a> Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).</li>
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<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+guidance+for+quantitative+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy.</a> Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).</li>
<li>Paulsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.T.S.+Biosynthesis%2C+tissue+distribution+and+isolation+of+laminins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Laminins%22%5BJournal%5D)">A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins.</a> The Laminins. , 1-26 (1994).</li>
<li>Fedecostante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recellularized+native+kidney+scaffolds+as+a+novel+tool+in+nephrotoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%3A+the+Biological+Fate+of+Chemicals%22%5BJournal%5D)">Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening.</a> Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).</li>
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<li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process%3A+a+ToF-SIMS+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li>
<li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+tissue+engineering+with+decellularized+rhesus+monkey+kidneys%3A+age-related+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+in+vivo+validation+of+tissue-engineered%2C+small-diameter+vascular+grafts+from+decellularized+aortae+of+fetal+pigs+and+canine+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101(2017).</li>
<li>Wu Young, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+fetal+matrix+suppresses+fibrotic+gene+expression+and+promotes+myogenesis+in+a+rat+model+of+volumetric+muscle+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

A MEC é uma rede complexa de macromoléculas que está presente em todos os tecidos e desempenha um papel crucial na regulação do comportamento e função celular2. A MEC atua como um arcabouço físico para as células se ligarem e fornece pistas que modulam ativamente os processos celulares, como proliferação, motilidade, diferenciação e apoptose. Assim, a formação e manutenção adequadas da MEC são essenciais tanto para o desenvolvimento quanto para a homeostase1.
<p class="...

A matriz extracelular (MEC) é um dos principais constituintes dos tecidos, representando seu componente não celular. Essa estrutura tridimensional (3D) não apenas fornece suporte físico para as células, mas também desempenha um papel crucial nos processos bioquímicos envolvidos no desenvolvimento dos organismos1. A formação de uma MEC tecido-específica ocorre durante o desenvolvimento, como resultado das complexas interações entre as células e seus nichos, influenciadas por diversos estímulos intra e extracelulares. A MEC é uma estrutura altamente dinâmica que sofre rearranjos químicos e mecânicos de forma espaço-temporal e impacta diretamente o destino dascélulas2. Uma das características mais notáveis da MEC é sua diversidade funcional, pois cada MEC tecidual apresenta uma combinação única de moléculas que fornecem diferentes topologias e propriedades adaptadas às células que contém1.
A sinalização e o suporte da MEC são cruciais para o desenvolvimento e a homeostase e, quando interrompidos, podem levar a múltiplas condições patológicas 3,4. Um exemplo é a distrofia congênita deficiente em LAMA2 (LAMA2-CMD), que é a forma mais comum de distrofia muscular congênita. O gene LAMA2 codifica a cadeia α2 da laminina, que está presente na laminina 211 e na laminina 221, e quando mutada pode levar à LAMA2-CMD 5. A laminina 211 é a principal isoforma encontrada na membrana basal que envolve as fibras musculares esqueléticas. Quando a laminina 211 é anormal ou ausente, a ligação entre a membrana basal e as células musculares é rompida, levando ao aparecimento da doença6. Pacientes com LAMA2-CMD apresentam um fenótipo leve a grave, dependendo do tipo de mutação no gene LAMA2.
Quando a função da proteína α2 da laminina é afetada, os pacientes podem experimentar hipotonia muscular grave ao nascimento e desenvolver inflamação crônica, fibrose e atrofia muscular, levando a uma redução da expectativa de vida. Até o momento, nenhum tratamento direcionado foi desenvolvido e as abordagens terapêuticas limitam-se a aliviar os sintomas da doença7. Portanto, a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes envolvidos no aparecimento dessa doença é crucial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticasapropriadas6,8. Trabalhos anteriores utilizando o camundongo dyW 9, modelo para LAMA2-CMD, sugerem que o início da doença inicia-se no útero, especificamente durante a miogênese fetal10. Uma melhor compreensão de como o defeito da miogênese fetal emerge seria um divisor de águas na geração de novas abordagens terapêuticas para LAMA2-CMD.
Sistemas in vitro fornecem um ambiente controlado para o estudo de interações célula-célula e célula-MEC, mas os modelos de cultura 2D carecem da complexidade dos tecidos nativos. A descelularização dos tecidos produz arcabouços acelulares de MEC específicos para o estágio de desenvolvimento e tecido que mimetizam com mais precisão o microambiente celular natural em comparação com modelos 2D e arcabouços artificiais/sintéticos. As matrizes decelularizadas (dECMs) têm o potencial de preservar as pistas moleculares e mecânicas do tecido hospedeiro, tornando-as melhores modelos alternativos para o entendimento de processos in vivo11.
Existem várias técnicas, reagentes e condições que podem ser utilizadas para a descelularização12,13. Neste estudo, um protocolo de descelularização para o coração fetal de camundongos, descrito por Silva et al.14,15, é adaptado ao músculo esquelético fetal de camundongos e retém todos os componentes da MEC testados (laminina α2, lamininas totais, fibronectina, colágeno I e colágeno IV). O protocolo inclui três etapas: lise celular por choque osmótico (tampão hipotônico), dissolução da membrana plasmática e dissociação proteica (dodecil sulfato de sódio a 0,05% [SDS]) e destruição enzimática do DNA (tratamento com DNase). Até onde sabemos, este é o primeiro protocolo estabelecido para a descelularização do músculo esquelético fetal de camundongos.
Para utilizar este sistema 3D in vitro para o estudo do LAMA2-CMD, é crucial manter a cadeia α2 da laminina após a decelularização. Portanto, um protocolo de otimização foi implementado onde diferentes detergentes (SDS e Triton X-100) e concentrações (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% e 0,5%) foram testados (dados não mostrados). A escolha ideal para remoção celular e preservação da proteína α2 da laminina foi SDS a 0,05%. Células C2C12, uma linhagem bem estabelecida de células mioblásticas16,17, foram usadas para semear as dECMs. Essas células invadem a dMEC, proliferam e se diferenciam no interior desses arcabouços, sintetizando novas proteínas da MEC. A produção bem-sucedida deste modelo in vitro 3D oferece uma nova abordagem para a compreensão dos processos moleculares e celulares envolvidos na miogênese fetal, no início da LAMA2-CMD, e pode ser estendida a outras doenças musculares onde a comunicação entre a MEC e as células musculares esqueléticas é interrompida.

<table><tbody><tr><td>Placa de Cultura de Células de 12 Poços, Plana, TC, Abdos Estéril</td><td>Labware</td><td>P21021</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato</td><td>Merck</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; Placa de Cultura de Células de 48 Poços de Gel Pré-moldado Mini-PROTEAN TGX</td><td>Bio-Rad</td><td>4561093</td><td></td>20%,</tr><tr><td>Plana, TC, Material de</td><td>Laboratório Abdos</td> Estéril <td>P21023</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Células de 96 Poços, Plana, TC, Material de Laboratório</td><td>Abdos</td> Estéril <td>P21024</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino, Fração V</td> Microscópio de fluorescência <td>NZYtech</td><td>MB04601</td><td></td></tr><tr><td>BX60</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Criostato CM1860 UV</td><td>Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>ThermoFisher</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>DMEM glicose alta com glutamina estável com piruvato de sódio</td><td>Biowest</td><td>L0103-500</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit de lenços </td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Merck</td><td>108418</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Biowest</td><td>S1560-500</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência de ponta fina</td><td>ThermoFisher</td><td>15387823</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Biowest</td><td>S2000-100</td><td></td></tr><tr><td>Hera Guard Flow Cabinet</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150 Incubadora de CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiMark Pre-stained Protein Standard</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum, origem neozelandesa</td><td>Gibco</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>HRP-&alpha;- Rabbit IgG</td><td>abcam</td><td>ab205718</td><td></td></tr><tr><td>HRP-&alpha;- Rat IgG</td><td>abcam</td><td>ab205720</td><td></td></tr><tr><td>HRP-&alpha;- Mouse IgG</td><td>abcam</td><td>ab205719</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ v. 1.53t</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metil Verde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67060</td><td></td></tr><tr><td>MM400 Tissue Lyser</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 Espectrofotômetro </td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído, 16% p/v aq. soln., sem metanol</td><td>Alfa Aesar</td><td>043368-9M</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (100x) </td><td>GRiSP</td><td>GTC05.0100</td><td></td></tr><tr><td>Faloidina Alexa 488 </td><td>Thermo Fisher Sci.</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de Poliestireno 60x15mm com aberturas (estéril)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628161</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&trade; 3 Fluorômetro</td><td>Invitrogen</td><td>15387293</td><td></td></tr><tr><td>S6E Zoom Microscópio Estéreo Leica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio</td><td>Merck</td><td>11667289001</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost&reg; Lâminas de adesão Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS Substrato Quimioluminescente</td><td>Thermo Scientific</td><td>15626144</td><td></td></tr><tr><td>TCS SPE microscópio confocal</td><td>Leica </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-(hidroximetil) aminometano (base Tris) &ge; 99%</td><td>VWR Chemicals</td><td>28811.295</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solução Azul de Tripano, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0.05%) em DPBS (1X)</td><td>GRiSP</td><td>GTC02.0100</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20 (Solução 50%)</td><td>ThermoFisher</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright PVDF-CL rolo de membrana (0.22&micro; m)</td> <td>Advansta</td><td>L-08024-001</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Colágeno I</td><td>abcam</td><td>ab21286</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-Colágeno IV</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Colágeno IV</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>sc-398655</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-Fibronectina</td><td>Sigma</td><td>F-3648</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-Laminina &alfa; 2 </td><td>Sigma</td><td>L-0663</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MHC</td><td>D.S.H.B.</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Mouse Alexa 488</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A11017</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Mouse Alexa 568</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A11019</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-pan-Laminina</td><td>Sigma</td><td>L- 9393</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-fosfo-histona 3</td><td>Merk Millipore</td><td>06-570</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Rabbit Alexa 568</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A21069</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Rabbit Alexa 488</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A11070</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Rato Alexa 488</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A11006</td><td></td></tr></tbody></table>

preparo de matrizes 3d descelularizadas de músculo esquelético de camundongos fetais para cultura celular

Preparation of 3D Decellularized Matrices from Fetal Mouse Skeletal Muscle for Cell Culture

A matriz extracelular (MEC) desempenha um papel crucial no fornecimento de suporte estrutural para as células e na transmissão de sinais que são importantes para vários processos celulares. Modelos bidimensionais (2D) de cultura de células simplificam demais as complexas interações entre células e a MEC, pois a falta de um suporte tridimensional completo (3D) pode alterar o comportamento celular, tornando-as inadequadas para a compreensão de processos in vivo . Deficiências na composição da MEC e nas interações célula-MEC são importantes contribuintes para uma variedade de diferentes doenças. 
Um exemplo é a distrofia muscular congênita LAMA2 (LAMA2-CMD), onde a ausência ou redução funcional das lamininas 211 e 221 pode levar a hipotonia grave, detectável no nascimento ou logo após o nascimento. Trabalhos anteriores usando um modelo murino da doença sugerem que seu início ocorre durante a miogênese fetal. O presente estudo teve como objetivo desenvolver um modelo 3D in vitro que permita o estudo das interações entre as células musculares e a MEC muscular fetal, mimetizando o microambiente nativo. Este protocolo utiliza músculos profundos das costas dissecados de fetos de camundongos E18.5, tratados com tampão hipotônico, detergente aniônico e DNase. As matrizes decelularizadas resultantes (dECMs) retiveram todas as proteínas da MEC testadas (laminina α2, lamininas totais, fibronectina, colágeno I e colágeno IV) em comparação com o tecido nativo. 
Quando os mioblastos C2C12 foram semeados sobre essas dECMs, eles penetraram e colonizaram as dECMs, o que apoiou sua proliferação e diferenciação. Além disso, as células C2C12 produziram proteínas da MEC, contribuindo para o remodelamento de seu nicho dentro das dECMs. O estabelecimento desta plataforma in vitro fornece uma nova abordagem promissora para desvendar os processos envolvidos no aparecimento da LAMA2-CMD, e tem o potencial de ser adaptada a outras doenças musculares esqueléticas onde deficiências na comunicação entre a MEC e as células musculares esqueléticas contribuem para a progressão da doença.

O objetivo do protocolo de decelularização é produzir dECMs que se assemelhe à composição do tecido nativo. Para determinar a eficácia do processo de decelularização, vários métodos foram empregados, incluindo exame da morfologia tecidual, medição dos níveis de DNA, coloração para F-actina e análise dos principais componentes da MEC usando técnicas de imunohistoquímica e western blotting. Especificamente, cinco componentes principais da MEC do tecido muscular esquelético foram analisados.
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Neste trabalho, um protocolo de decelularização foi otimizado para obter matrizes descelularizadas do músculo esquelético fetal de camundongos. Os mioblastos C2C12 podem colonizar essas matrizes, proliferar e diferenciar-se. Este modelo in vitro pode ser utilizado para estudar o comportamento celular no contexto de doenças musculares esqueléticas, como as distrofias musculares.

Preparo de Matrizes 3D Descelularizadas de Músculo Esquelético de Camundongos Fetais para Cultura Celular

The extracellular matrix (ECM) plays a crucial role in providing structural support for cells and conveying signals that are important for various ...

Até onde sabemos, este protocolo é o primeiro a produzir matrizes decelularizadas a partir do músculo esquelético fetal, fornecendo uma nova abordagem para o estudo de miopatias que começam a se desenvolver no útero. Este protocolo gera uma métrica de desenvolvimento e tecido-específica que pode ser usada para estudar o comportamento das células musculares e interações com a matriz extracelular em um ambiente controlado. A DMC-LAMA2 é uma distrofia muscular congênita que começa a se manifestar ao nascimento.Esse modelo pode ajudar a desvendar os mecanismos padrão envolvidos em seu início e levar a novas terapias-alvo. Este protocolo pode ser adaptado a diferentes tecidos e modelos de doenças. Diferentes níveis de complexidade podem ser alcançados dependendo da matriz e dos tipos celulares, demonstrando a versatilidade do sistema.Este é um protocolo muito simples. A parte mais desafiadora é a coleta e o manuseio das amostras. Mas, com a prática, as habilidades técnicas podem ser facilmente melhoradas.Comece transferindo um feto eutanasiado de cada vez para uma placa de Petri contendo PBS gelado. Depois de excisar a pele e os membros, corte o lado ventral da caixa torácica. Remova o

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Isso detalhes o trabalho de preparação de fibrina scaffolds 3D para cultura e diferenciação das células-tronco plutipotent. Tais suportes podem ser usados ​​para examinar os efeitos de vários compostos biológicos sobre o comportamento das células estaminais, bem como modificada para conter sistemas de entrega de drogas.

Preparação de fibrina Andaimes 3D para aplicações de cultura de células-tronco

Tecido muscular de engenharia tem um grande potencial na medicina regenerativa, como modelo de doença e também como uma fonte alternativa para a carne. Aqui descreve-se a engenharia de uma construção de músculo, neste caso, a partir de células progenitoras, mioblastos de rato e a estimulação por pulsos eléctricos.

Os tecidos músculo esquelético de engenharia a partir de células progenitoras mioblastos murinos e Aplicação da estimulação elétrica

Até o momento, os defeitos de tecido espesso são normalmente reconstruídos com a aplicação de retalhos de tecido autólogo ou tecidos projetados. Neste protocolo, apresentamos um novo método de engenharia de retalho de tecido vascularizado com pedículo autólogo, para servir como substituto dos retalhos autólogos.

Projetado retalho do músculo vascularizada

Nestes estudos, que fornecem metodologia para novos, neonatal, andaimes cardíacas murinas para uso em estudos de regeneração.

Neonatal Cardiac Scaffolds: Matrizes novas para Estudos Regenerativa

A matriz extracelular específico do tecido (ECM) é um mediador chave da função das células. Este artigo descreve métodos para a síntese de espumas e microtransportadores que são estáveis em cultura sem a necessidade de reticulação química para aplicações em 3D avançada em modelos de cultura celular in vitro ou como bioscaffolds pró-regenerativos derivado de ECM puros.

Fabricação de espumas de Matriz Extracelular derivados e Microcarregadores como cultura celular de tecidos específicos e plataformas de entrega

A cardíaca matriz extracelular (ECM) é uma rede complexa de moléculas que orquestrar processos-chave em tecidos e órgãos enquanto duradoura remodelamento fisiológico durante toda a vida. Decellularization padronizada do coração fetal e adulta permite estudos comparativos de experimentais de ambos os tecidos em um contexto 3D capturando arquitetura nativa e propriedades biomecânicas.

Decellularization comparável de explantes de tecido cardíaco Fetal e adulto como plataformas 3D-como para estudos de Vitro

Este protocolo descreve a produção de filamento policaprolactona (PCL) com microesferas de (PLA) de ácido polilático incorporado que contêm matrizes decellularized (DM) para impressão 3D estruturais de engenharia de tecidos construções.

Novo processo de impressão 3D Decellularized matrizes

A identificação precisa de células progenitoras fibro-adipogênicas (FAPs) e células-tronco musculares (MuSCs) é fundamental para estudar sua função biológica em condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo fornece diretrizes para o isolamento, purificação e cultura de FAPs e MuSCs de músculos de camundongos adultos.

FACS-isolamento e Cultura de Progenitores Fibro-Adipogênicos e Células-Tronco Musculares de Músculo Esquelético não perturbado e lesionado

Este protocolo fornece métodos para gerar tecidos cardíacos e musculares esqueléticos modificados em 3D e descreve seu uso em modalidades de triagem pré-clínica de medicamentos. Os métodos descritos utilizam um sistema de detecção magnética para facilitar a avaliação simultânea de 24 tecidos em paralelo.

Teste pré-clínico de drogas em tecidos musculares escaláveis de engenharia 3D

Um método reprodutível é apresentado para gerar tecidos miocárdicos 3D combinando scaffolds de escrita eletrospinning (MEW), policaprolactona (PCL) e hidrogéis de fibrina com cardiomiócitos e fibroblastos derivados de hiPSC. Essa técnica oferece controle preciso sobre a arquitetura do andaime e pode ser aplicada em testes pré-clínicos de medicamentos e modelagem de doenças cardíacas.

Geração de tecido miocárdico humano 3D usando escrita eletrogiratória por fusão de andaimes de policaprolactona e células cardíacas derivadas de hiPSC

Este protocolo descreve a fabricação de construções ósseas 3D utilizando osteócitos humanos embutidos em hidrogéis de gelatina metacrilada (GelMA) suplementados com matriz extracelular descelularizada. O método é de baixo custo, escalável e compatível com equipamentos laboratoriais básicos, fornecendo uma plataforma translacional para o estudo dos processos de doenças musculoesqueléticas.

Uma plataforma de cultura óssea 3D usando osteócitos humanos e matriz extracelular descelularizada para modelagem de doenças musculoesqueléticas

Aprenda a preparar matrizes descelularizadas de músculo esquelético fetal de camundongo para cultura de células C2C12. Este método permite estudar miopatias congênitas e interações celulares in vitro.

Preparo de Matrizes 3D Descelularizadas de Músculo Esquelético de Camundongos Fetais para Cultura Celular

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