Bioorthogonale chemische beeldvorming van celmetabolisme gereguleerd door aromatische aminozuren

We presenteren een nieuwe beeldvormingstechniek met labelvrije mogelijkheden, hoge chemische specificiteit en subcellulaire resolutie. Onze methodologie kan een vraag beantwoorden over metabole disfunctie bij veroudering en ziekten zoals kanker Raman-beeldvorming, in combinatie met twee fotonenfluorescentie en tweede harmonische generatie, biedt een niet-destructieve en labelvrije beeldvormingstechnologie die minimale monstervoorbereiding vereist en een hoge subcellulaire resolutie bereikt zonder het celmonster te beschadigen. Verschillende beeldvormingsmodaliteiten worden gebruikt als onderdeel van ons platform.

Individuen moeten ons protocol zo goed mogelijk volgen en opmerken dat ons systeem zelfgebouwd is. Onderweg moeten ze hun eigen praktijk ontwikkelen om succes te garanderen. Begin in twee afzonderlijke buizen met het meten en mengen van 10 milligram DMEM-poeder met 4,7 milliliter dubbel gedestilleerd water in een conische buis van 15 ml.

Draai de buis grondig om en keer deze om om ervoor te zorgen dat de oplossing goed wordt gemengd. Voeg voor beide buizen 4,7 ml deuteriumoxide, 0,5 ml FBS en 0,1 ml penicilline en streptomycine toe voordat u de buis vortext en omkeert. Voeg vervolgens overtollige fenylalanine toe aan één buis en overtollig tryptofaanpoeder aan de tweede buis en meng opnieuw.

Voeg methionine en threonine toe met respectievelijk 30 en 95 mg per ml aan beide buizen, gevolgd door vortexing en omkering van de buis. Filter daarna de voorbereide media met een spuitfilter van 25 millimeter met filters van 0,22 micrometer. Verzegel alle media met conische buizen met Parafilm.

Bewaar voorbereide media bij vier graden Celsius. Behoud healercellen in een kweekkolf met behulp van standaard DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline en streptomycine. Subcultuur de healer cellen in een split ratio van één tot 10 tot het bereiken van 80% of hoger cel levensvatbaarheid.

Voordat de cellen worden gezaaid, dompelt u de gesteriliseerde Poly-D-Lysine, met laminine beklede, ronde afdekking met een diameter van 12 mm onder in 70% ethanol. Droog de afdekslips met pluisvrije doekjes en plaats de schone afdekstroken in de juiste putjes van de plaat. Was de cellen eenmaal met PBS zonder magnesium- en calciumionen.

Voeg 0,25% trypsine toe om de hechtcellen van de kolf te scheiden en incubeer gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Voeg vervolgens DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline en streptomycine toe aan de cellen. Pipeteer zachtjes op en neer.

Verzamel de cellen door centrifugeren bij 300 G gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Suspensie vervolgens de cellen opnieuw in DMEM aangevuld met 0,5% FBS en 1% penicilline en streptomycine. Tel de trypan blauwe vlekcellen met behulp van een hemocytometer onder een lichtmicroscoop en zaad met een dichtheid van twee keer 10 tot de vijfde cellen per put van een 24-putplaat.

Verdeel de cellen gelijkmatig door de plaat voorzichtig te schudden. Incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Vervang na acht uur de oude kweekmedia door 50% deuteriumoxide en overtollig fenylalanine of 50% deuteriumoxide en overtollige tryptofaanmedia.

Breng de cellen terug naar de incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 36 uur. Bereid nu microscoopglaasjes voor met beeldruimtes met een diameter van negen mm. Plaats 15 microliter PBS, aangevuld met calcium- en magnesiumionen en spoel de cellen met dezelfde oplossing.

Voeg 0,5 ml 4% methanolvrije paraformaldehyde-oplossing toe en laat de plaat 15 minuten onder de bioveiligheidskap liggen. Zuig de paraformaldehyde-oplossing aan en spoel deze af met PBS, tweemaal aangevuld met calcium en magnesiumijzer. Voeg een ml PBS, aangevuld met calcium- en magnesiumionen, toe aan elke put.

Gebruik een steriel pincet om de afdekslip van elke put zorgvuldig te verwijderen. Keer ze om en plaats de cel met de zijkant op de beeldvormingsruimten in contact met de PBS. Sluit de buitenste laag van de afdekslip af met de imaging spacer met transparante nagellak.

Laad het biologische monster op de monsterhouder direct onder de objectieflens. Klik vervolgens op het camerapictogram in de software om de videocamera in te schakelen en het scherpstelvlak aan te passen om een interessant gebied te identificeren met de 50X-objectieflens. Schakel over naar de 100X objectieflens.

Klik op het stoppictogram om de videocamera uit te schakelen. Selecteer vervolgens een rooster van 1.800 lijnen per mm en stel het acquisitiebereik in van 400 tot 3.150 centimeter omgekeerd. Stel ten slotte de acquisitietijd in op 90 seconden, de accumulatie op drie en de binning op vier voor de minste ruis en het meest nauwkeurige spectrum.

Klik op start om de laser op te warmen. Begin door de hoofdschakelaar van de bedieningskast IX3CBH op Aan te drukken, gevolgd door de hoofdschakelaar van de aanraakpaneelcontroller. Schakel vervolgens de hoofdschakelaar van de wisselstroomadapter van de voeding in voor LDOBIS6 laserafstandsbediening die is aangesloten op de fv31s-kam van de hoofdlasercombiner.

Schakel ook de AC-adapter van de LDOBIS6 laserafstandsvoeding in die is aangesloten op de sublasercombiner FV31S-kam. Druk daarna op de hoofdschakelaars van de SI-fotodiodedetector en lock-in versterker. Stel de laser-IR in op 1031 nanometer Stel het pico smaragdsysteem in op een instelbare golflengte tussen 720 en 990 nm.

Monteer het monster op de olie en plaats een grote waterdruppel op de microscoopglaasje waar het monster is bevestigd. Selecteer scangrootte als 512 bij 512 pixels. Verkrijg en bewaar de beelden als een Olympus.

OIR grafisch bestand. Nadat u het signaal op 862.0 hebt ingesteld, krijgt u een achtergrondafbeelding en slaat u deze op. Stel de verblijftijd in op acht microseconden per pixel en de pixelgrootte op 512 bij 512 pixels.

Stel de lasersluitervermogensparameter in op 150 milliwatt Voor 3D-beeldreconstructie stemt u het gestimuleerde Raman-verlies af op 2.850 cm inverse. Zodra de gewenste afzonderlijke cellen zijn geïdentificeerd, registreert u de laser om vanaf het bovenste focusvlak te scannen om de bovenste en onderste lagen van die cellen te detecteren. Deuteriumoxide, gesondeerd, gestimuleerd Raman-verstrooiing werd gebruikt om de ruimtelijke verdeling van CD-signalen op afzonderlijke cellen te visualiseren.

De controlecellen vertoonden matige CD-, lipide- en eiwitbanden. De 15 x v en 15 x trip vertoonden echter sterkere CD-lipiden- en eiwitverboden. Kwantitatieve analyse gaf aan dat overtollige aromatische aminozuren de lipidesynthese met 10 tot 17% kunnen upreguleren, maar de eiwitsynthese met 10% kunnen downreguleren Metrische analyse van met aromatische aminozuren behandelde cellen toonde een toename van 50% in flavine gedeeld door flavine plus NADH en een toename van 10% in onverzadigde lipide gedeeld door verzadigde lipide.

De gestimuleerde Raman 3D lipide druppel volume projectie in healer cellen onder controle en overtollige aromatische aminozuren condities worden getoond. Kwantitatieve analyses van 3D-lipidedruppels toonden een toename van het aantal, maar een afname in grootte van met aromatische aminozuren behandelde cellen in vergelijking met de controle. Beeldvormingsparameters voor Raman en twee foton fluorescerende beeldvorming moeten van het ene monster naar het andere worden geoptimaliseerd om de beste beeldkwaliteit te garanderen.

Individuen kunnen ons systeem koppelen aan de tweede harmonische generatie om de collageenstructuur te bestuderen, die vroege metabole veranderingen in veroudering en ziekten opheldert en de progressie van neurodegeneratie of kanker begrijpt. Onze technologie is de eerste van deze soort die lipide- en eiwitsynthese visualiseert in biologische systemen met een hoge subcellulaire resolutie. De technologie kan ook worden vertaald naar een kliniek voor niet-invasieve ziektedetectie.