Name: דיסקציה של Stria vascularis עכבר בוגר עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: למדו לבצע דיסקציה של Stria vascularis בעכברים בוגרים לצורך ריצוף גרעין יחיד ו-immunostaining. שיטה זו מאפשרת מיפוי הנוף התעתיקי וחקר מנגנוני הליקוי בשמיעה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר האינטרמורלית של ה-NIH, NIDCD to M.H. (DC000088)

Stria Vascularis Microdissection עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining

<ol><li>Bosher, S. K., Warren, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+electrochemistry+of+the+cochlear+endolymph+of+the+rat%3A+a+quantitative+study+of+its+electrical+potential+and+ionic+composition+as+determined+by+means+of+flame+spectrophotometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).</li>
<li>Patuzzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+flow+in+stria+vascularis+and+the+production+and+regulation+of+cochlear+endolymph+and+the+endolymphatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential.</a> Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).</li>
<li>Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K%2B+cycling+and+the+endocochlear+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">K+ cycling and the endocochlear potential.</a> Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).</li>
<li>Adachi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+underlying+maintenance+of+the+endocochlear+potential+by+the+K%2B+transport+system+in+fibrocytes+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear.</a> The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).</li>
<li>Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+the+highly+positive+endocochlear+potential+formed%3F+The+specific+architecture+of+the+stria+vascularis+and+the+roles+of+the+ion-transport+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus.</a> Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).</li>
<li>Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+channels+and+transporters+expressed+in+the+inner+ear+and+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).</li>
<li>Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+%26%2334%3Bcochlear+battery%26%2334%3B-claudin-11+barrier+and+ion+transport+proteins+in+the+lateral+wall+of+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The human &#34;cochlear battery&#34;-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239(2017).</li>
<li>Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNJ10+%28Kir4.1%29+potassium+channel+knockout+abolishes+endocochlear+potential%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).</li>
<li>Spicer, S. S., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+inner+ear+fibrocytes+according+to+their+ion+transport+related+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity.</a> Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).</li>
<li>Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+transport+mechanisms+responsible+for+K%2B+secretion+and+the+transepithelial+voltage+across+marginal+cells+of+stria+vascularis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro.</a> Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).</li>
<li>Yoshida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+ion+permeability+profile+of+cochlear+fibrocytes+and+its+contribution+to+establishing+their+positive+resting+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">The unique ion permeability profile of cochlear fibrocytes and its contribution to establishing their positive resting membrane potential.</a> Pflugers Archiv. 468 (9), 1609-1619 (2016).</li>
<li>Johns, J. D., Adadey, S. M., Hoa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+stria+vascularis+in+neglected+otologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The role of the stria vascularis in neglected otologic disease.</a> Hearing Research. 428, 108682(2023).</li>
<li>Kim, J., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+real-time+imaging+reveals+megalin+as+the+aminoglycoside+gentamicin+transporter+into+cochlea+whose+inhibition+is+otoprotective%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo real-time imaging reveals megalin as the aminoglycoside gentamicin transporter into cochlea whose inhibition is otoprotective.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (9), e2117846119(2022).</li>
<li>Zdebik, A. A., Wangemann, P., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+ion+movement+in+the+inner+ear%3A+insights+from+genetic+disease+and+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Potassium ion movement in the inner ear: insights from genetic disease and mouse models.</a> Physiology. 24, 307-316 (2009).</li>
<li>Chen, J., Zhao, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+an+inwardly+rectifying+K%2B+channel+%28Kir4.1%29+in+the+inner+ear+and+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of an inwardly rectifying K+ channel (Kir4.1) in the inner ear and hearing loss.</a> Neuroscience. 265, 137-146 (2014).</li>
<li>Steel, K. P., Barkway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+role+for+melanocytes%3A+their+importance+for+normal+stria+vascularis+development+in+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Another role for melanocytes: their importance for normal stria vascularis development in the mammalian inner ear.</a> Development. 107 (3), 453-463 (1989).</li>
<li>Ito, T., Nishio, A., Wangemann, P., Griffith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+irreversible+hearing+loss+is+caused+by+stria+vascularis+degeneration+in+an+Slc26a4-insufficient+mouse+model+of+large+vestibular+aqueduct+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome.</a> Neuroscience. 310, 188-197 (2015).</li>
<li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+rare+spindle+and+root+cell+transcriptional+profiles+in+the+stria+vascularis+of+the+adult+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18100(2020).</li>
<li>Gow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deafness+in+claudin+11-null+mice+reveals+the+critical+contribution+of+basal+cell+tight+junctions+to+stria+vascularis+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).</li>
<li>Chang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virally+mediated+Kcnq1+gene+replacement+therapy+in+the+immature+scala+media+restores+hearing+in+a+mouse+model+of+human+Jervell+and+Lange-Nielsen+deafness+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).</li>
<li>Faridi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+and+phenotypic+spectra+of+KCNE1+deficiency+in+Jervell+and+Lange-Nielsen+Syndrome+and+Romano-Ward+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome.</a> Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).</li>
<li>Wangemann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+KCNJ10+protein+expression+abolishes+endocochlear+potential+and+causes+deafness+in+Pendred+syndrome+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model.</a> BMC Medicine. 2, 30(2004).</li>
<li>Kitajiri, S. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+claudins%2C+tight+junction+adhesion+molecules%2C+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear.</a> Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).</li>
<li>Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+properties+of+cochlear+root+cells+are+consistent+with+roles+in+potassium+recirculation+and+spatial+buffering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).</li>
<li>Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+in+the+stria+vascularis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages in the stria vascularis.</a> Frontiers in Neurology. 13, 818395(2022).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGFA165+gene+therapy+ameliorates+blood-labyrinth+barrier+breakdown+and+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss.</a> JCI Insight. 6 (8), e143285(2021).</li>
<li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+the+cochlear+intrastrial+fluid-blood+barrier+%28review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review).</a> Hearing Research. 338, 52-63 (2016).</li>
<li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+Meniere%27s+disease+targets+in+the+adult+stria+vascularis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis.</a> Frontiers in Neurology. 12, 630561(2021).</li>
<li>Fischer, J., Ayers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nucleus+RNA-sequencing%3A+how+it%27s+done%2C+applications+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Topics+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).</li>
<li>Korrapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+and+single+nucleus+RNA-Seq+reveal+cellular+heterogeneity+and+homeostatic+regulatory+networks+in+adult+mouse+stria+vascularis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316(2019).</li>
<li>Pyle, M. P., Hoa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+single-cell+sequencing+for+the+field+of+otolaryngology%3A+A+contemporary+review%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope+Investigative+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review.</a> Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li>
<li>Shafer, M. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+analysis+of+single-cell+transcriptomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175(2019).</li>
<li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-Seq+technologies+and+related+computational+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317(2019).</li>
<li>Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+and+spatial+transcriptomics+to+elucidate+intercellular+tissue+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics.</a> Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).</li>
<li>Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+single-nucleus+RNA+sequencing+in+different+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-sequencing+from+single+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visuazlied+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561(2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

לפני הופעתו של ריצוף תא יחיד, חוקרים רבים השתמשו בניתוח רקמות בתפזורת, אשר איפשר רק לנתח תעתיקים ממוצעים על פני תאים. בפרט, תא בודד ו- sNuc-Seq אפשרו לבודד את התעתיק של תא בודד או גרעין יחיד, בהתאמה32. במקרה זה, ניתן לזהות תעתיקי גרעין יחיד עבור תאים שוליים, בינוניים ובזאליים, כמו גם תאי ציר30. זה מאפשר לחקור הטרוגניות שעתוק בין סוגי תאים SV וניתן להשתמש בו בעתיד כדי לחקור את התרומה של סוגי תאים אלה לתפקוד SV, כולל יצירה ותחזוקה של EP. מערכי נתונים שנוצרו באמצעות sNuc-Seq י...

השבלול מורכב משלושה תאים מלאים בנוזל, סקאלה וסטיבולי, סקאלה מדיה וסקלה טימפני. סקאלה וסטיבולי וסקלה טימפאני מכילים כל אחד פרילימפה, אשר יש ריכוז גבוה של נתרן (138 mM) וריכוז נמוך של אשלגן (6.8 mM)1. מדיה סקאלה מכיל endolymph, אשר יש ריכוז גבוה של אשלגן (154 mM) וריכוז נמוך של נתרן (0.91 mM)1,2,3. הבדל זה בריכוז היונים יכול להיקרא פוטנציאל אנדוקוכליארי (EP), והוא נוצר בעיקר על ידי תנועה של יוני אשלגן דרך תעלות יונים שונות וצמתים מרווחים בסטריה וסקולריס (SV) לאורך הדופן הצידית של השבלול 4,5,6,7,8,9,10,11 . SV היא רקמה הטרוגנית, מאוד וסקולרית, שמרפדת את האספקט המדיאלי של הדופן הצידית של השבלול ומכילה שלושה סוגי תאים עיקריים: תאים שוליים, תאי ביניים ותאי בסיס12 (איור 1).
תאי שוליים מחוברים על ידי צמתים הדוקים כדי ליצור את המשטח המדיאלי ביותר של SV. הממברנה האפיקלית פונה לאנדולימפה של מדיה סקאלה ותורמת להעברת יוני אשלגן לתוך האנדולימפה באמצעות ערוצים שונים, כולל KCNE1/KCNQ1, SLC12A2 ו-Na+-K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. תאי ביניים הם תאים פיגמנטיים השוכנים בין תאים שוליים לתאי בסיס ומאפשרים העברת אשלגן דרך SV באמצעות KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. תאי הבסיס נמצאים בסמיכות לדופן הצידית של השבלול וקשורים קשר הדוק עם פיברוציט של הרצועה הספירלית כדי לקדם מחזור אשלגן מהפרילימפה12. פתולוגיה של SV הייתה מעורבת בהפרעות אוטולוגיות רבות17,18. מוטציות בגנים המתבטאים בסוגי תאי SV העיקריים, כגון Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 ו-Cldn11, עלולות לגרום לחירשות ולתפקוד לקוי של SV, כולל אובדן EP 19,20,21,22,23. בנוסף לשלושת סוגי התאים העיקריים, ישנם סוגי תאים אחרים פחות נחקרים ב-SV, כגון תאי ציר 22, תאי שורש12,24, מקרופאגים 25, פריציטים 26 ותאי אנדותל 27, שיש להם תפקידים לא מוגדרים לחלוטין הקשורים להומאוסטזיס יוני וליצירת EP 28.
בהשוואה לריצוף רנ"א בתפזורת, ריצוף רנ"א חד-גרעיני (sNuc-Seq) מספק מידע על הטרוגניות התא, ולא ממוצע של mRNA על פני קבוצת תאים29, ויכול להיות שימושי במיוחד כאשר חוקרים את SV30 ההטרוגני. לדוגמה, sNuc-Seq הפיק ניתוח שעתוק המצביע על כך שייתכן שיש תפקיד לתאי ציר ושורש ביצירת EP, אובדן שמיעה ומחלת מנייר18. אפיון שעתוק נוסף של סוגי תאי SV השונים יכול לספק לנו מידע רב ערך על הפתופיזיולוגיה העומדת בבסיס מנגנונים ותת-סוגים שונים של תנודות שמיעה הקשורות ל-SV ואובדן שמיעה. הקציר של מבני האוזן הפנימית העדינים הללו הוא בעל חשיבות עליונה לניתוח רקמות אופטימלי.
במחקר זה מתוארת גישת המיקרודיסקציה לגישה ולבידוד של כלי הדם הסטריה משברלול העכבר הבוגר עבור sNuc-Seq או immunostaining. דיסקציה של SV עכבר בוגר נדרשת כדי להבין סוגים שונים של תאי SV ולאפיין עוד יותר את תפקידם בשמיעה.

<table><tbody><tr><td>10 ומיקרו; מסנן m (Polyethylenterephthalat)</td><td>PluriSelect</td><td>#43-50010-01</td><td>רקמת סינון במהלך sNuc-Seq</td></tr><tr><td>18 x 18 מ"מ כיסוי זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-541A</td><td>החלקת כיסוי להרכבה SV</td></tr><tr><td>30-&micro; מסנן m (Polyethylenterephthalat)</td><td>PluriSelect</td><td>#43-50030-03</td><td>סינון רקמות במהלך sNuc-Seq</td></tr><tr><td>75 x 25 מ"מ Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide</td><td>Daigger</td><td></td><td>EF15978Z-Microslide להרכבת SV על</td></tr><tr><td>עכברי C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID: IMSR_JAX:000664</td><td>זן עכבר לשימוש כללי שיש לו פיגמנט שנראה ביתר קלות בתאי הביניים של ה-SV.</td></tr><tr><td>Cell Counter</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>משמש לספירת תאים</td></tr><tr><td>Chalizon curette 5 '', גודל 3 2.5 מ"מ</td><td>מכשירי מחקר ביו-רפואיים</td><td>15-1020</td><td>משמש להעברת SV</td></tr><tr><td>כרום הבא GEM תא יחיד 3' ערכת GEM v3.1</td><td>כרום</td><td>PN-1000141</td><td>מייצר ספריות ביטוי גנים של תא יחיד 3'</td></tr><tr><td>לק שקוף</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC1849418</td><td>משמש לאיטום SV mount</td></tr><tr><td>Corning Falcon כלי תרבית רקמות סטנדרטיים, 24 באר</td><td>צלחת תרבית קורנינג</td><td>08-772B</td><td>המשמשת להחזקת דגימה במהלך דיסקציה</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306, RRID: AB_2629482</td><td>כתם המשמש לתיוג גרעין</td></tr><tr><td>הומוגנייזר</td><td>Dounce Sigma-Aldrich</td><td>D8938</td><td>משמש להומוגניזציה של רקמות עבור sNuc-seq</td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>מלקחיים כלליים לדיסקציה</td></tr><tr><td>Dumont #55 מלקחיים</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11255-20</td><td>מלקחיים עם קצה עדין המקל על מניפולציה של SV</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>משמש לשלבים של מקל דבק sNuc-Seq</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0691392</td><td>משמש להרכבת</td></tr><tr><td>נוגדן SV GS-IB4 מולקולרי</td><td> בדיקות</td><td>I21411, RRID: AB-2314662</td><td>נוגדן המשמש לתיוג נימי</td></tr><tr><td>KCNJ10-ZsGreen עכברים</td><td>n/a</td><td>n/a עכבר</td><td>טרנסגני המבטא KCNJ10-ZsGreen, באופן חלקי בתאי הביניים של ה-SV.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9530G</td><td>משמש לשלבים של sNuc-Seq</td></tr><tr><td>מגיב הרכבה</td><td>ThermoFisher</td><td>#S36940</td><td>מגיב הרכבה לצלחת SV</td></tr><tr><td>Multiwell 24 באר</td><td>Corning</td><td>#353047</td><td>צלחת המשמשת לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ216183</td><td>משמש לשלבים של sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9-16-45-9</td><td>משמש לשלבים של sNuc-Seq</td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>ThermoFisher</td><td>4387936</td><td>משמש לשלבים של שייקר אורביטלי sNuc-Seq</td></tr><tr><td></td><td>Silent Shake</td><td>SYC-2102A</td><td>משמש לשלבים של צביעה חיסונית</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>J61196. AP</td><td>משמש לשלבים של צביעה חיסונית ודיסקציה</td></tr><tr><td>RNA מאוחר יותר</td><td>Invitrogen</td><td>AM7021</td><td>משמש לשימור SV עבור sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Scizzors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>משמש לפיצול גולגולת עכבר</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15506017</td><td>משמש לשלבים של sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Trypan כתם כחול</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>משמש לספירת תאים</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ20605AP&nbsp;</td><td>משמש לשלבים של sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Zeiss STEMI SV 11 Apo סטריאומיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>מיקרוסקופ המשמש לנתיחות</td></tr></tbody></table>

דיסקציה של stria vascularis עכבר בוגר עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining

Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

הפוטנציאל האנדוקוכליארי, אשר נוצר על ידי כלי הדם stria, הוא חיוני כדי לשמור על סביבה תורמת mechanotransduction תאי שיער מתאים ובסופו של דבר שמיעה. פתולוגיות של כלי הדם stria יכול לגרום לירידה בשמיעה. דיסקציה של הסטריה וסקולריס הבוגרת מאפשרת לכידה ממוקדת של גרעין יחיד ולאחר מכן ריצוף גרעין יחיד וצביעת חיסון. טכניקות אלה משמשות לחקר פתופיזיולוגיה של סטריה וסקולריס ברמת התא היחיד. 
ריצוף גרעין יחיד יכול לשמש בהגדרה של ניתוח שעתוק של כלי הדם stria. בינתיים, צביעת מערכת החיסון ממשיכה להיות שימושית בזיהוי אוכלוסיות ספציפיות של תאים. שתי השיטות דורשות דיסקציה נכונה של stria vascularis כתנאי מוקדם, אשר יכול להוכיח להיות מאתגר מבחינה טכנית.

אנו מציגים שיטה לבודד את SV לשימוש עבור sNuc-Seq או immunostaining. האנטומיה הרלוונטית (איור 1) של השבלול ביחס ל-SV יכולה לעזור למשתמשים להבין טוב יותר את הארגון של SV ואת השלבים של פרוטוקול הדיסקציה.
כל שלב של מיקרו-דיסקציה זו של SV מעכבר P30 מפורט בווידיאו המשויך, ותצלומי בזק של שלבי המפתח של הדיסקציה והבידוד של SV מוצגים באיור 2.
sNuc-Seq שימושי בחקירת פרופיל השעתוק של התאים השונים ב-SV ההטרוגני. דרך אחת...

הסטריה וסקולריס חיונית ליצירת הפוטנציאל האנדוקוכליארי. כאן, אנו מציגים את הדיסקציה של העכבר הבוגר stria vascularis עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining.

דיסקציה של Stria vascularis עכבר בוגר עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell ...

הסטריה וסקולריס פועלת ליצירת הפוטנציאל האנדוקוכליארי ולוויסות הומאוסטזיס היונים בשבלול. תוכנית ההתפתחות והשיקום השמיעתי מבקשת להבין את המנגנונים הבסיסיים המקשרים בין הומאוסטזיס יונים לא מתפקד לבין הפרעות שמיעה ויציבות, שהן מחלות שבהן מתרחשת תנודה או אובדן שמיעה פתאומי. העבודה במעבדה שלי ביססה את נוף השעתוק של הסטריה וסקולריס ותרמה להבנתנו את חשיבותה בשמיעה.השתמשנו בנתונים אלה כדי ליצור הקבלות להפרעות שמיעה ויציבות שאינן מובנות היטב, כולל מחלת מנייר. פרוטוקול זה מאפשר דיסקציה ובידוד של כלי דם סטריה שלמים למחקרים מולקולריים נוספים, כולל אימונוהיסטוכימיה. בהתחשב בכך שסוגי תאי סטריה וסקולריס שזורים זה בזה באופן מורכב, השימוש בבידוד גרעיני וריצוף RNA של גרעין יחיד הקל על הבנתנו את מנגנון השעתוק הייחודי המעורב.

dissection-adult-mouse-stria-vascularis-for-single-nucleus-sequencing

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: Daynac, M., et. al. מיון תאים של תאי גזע עצביים ותאי אב מהאזור התת-חדרי של העכבר הבוגר והדמיה חיה של דינמיקת מחזור התא שלהם. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים הדמיה בהילוך מהיר של תאי גזע עצביים (NSCs) ממוח של עכבר טרנסגני באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. תאי גזע עצביים זוהרים באדום במהלך שלב G1 ואינם פלואורסצנטיים בשלבים אחרים של מחזור התא. תרבית NSC מודבקת מונחת בתא ההדמיה, נקבעים פרמטרי הדמיה, והתמונות נלכדות במרווחי זמן קבועים למשך הזמן הרצוי.

הדמיית זמן-lapse של חלוקת תאי גזע עצביים של עכבר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

כאן אנו מתארים הליך המבוסס על שימוש בחלקיקים לנטי-ויראלים לשינוי גנטי ארוך טווח של תאי גזע עצביים ו/או תאי אפנדימליים סמוכים להם בנישה הנוירוגנית הגחנית-תת-חדרית הבוגרת המאפשרת ניתוח נפרד של השפעות אוטונומיות ולא אוטונומיות של תאים, תלויות נישה על תאי גזע עצביים.

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד במהירות את הגרעינים באיכות גבוהה מן הרקמה טרי או קפוא עבור רצפי RNA בנפט מקבילים במורד הזרם. אנו כוללים רקמת חומרי ניקוי-מכניים, היפוטוניק-מכניים הפרעה ותא פירוק אפשרויות, אשר שניהם יכול לשמש עבור בידוד של גרעין האטום.

בידוד של חוט השדרה למבוגרים גרעינים עבור רצפי RNA חד-גרעין בנפט מקבילים

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

פרוטוקול זה מתאר מיקרו-דיסקציה בסיוע טרנסילומינציה של מקטעים של צינוריות עכבר בוגרות למחצה המייצגות שלבים ספציפיים של מחזור אפיתל חצי-היקפי, וסוגי תאים בו, וחיסון לאחר מכן של תכשירי סקווש ומקטעי צינור שלמים.

ניתוח בסיוע Transillumination של שלבים ספציפיים של מחזור האפיתל החצי-שנתי של העכבר לניתוחים Immunostaining במורד הזרם

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד גרעינים איכותיים מכליות עכבר קפואות המשפרים את ייצוג סוגי תאי הכליה המדולריים ומונעים את ביטוי הגנים מדיסוציאציה אנזימטית של רקמות.

בידוד גרעינים מכליה של עכבר בוגר לריצוף RNA של גרעין יחיד

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה המפורטת של דגימות בעלות קלט נמוך לריצוף גרעין יחיד, כולל כריתה של צוואר הרחם העליון של העכבר וגרעיני סטלאט, דיסוציאציה של תאים, שימור בהקפאה, בידוד גרעין וברקוד האשטאגים.

בידוד גרעין בעל קלט נמוך וריבוב עם נוגדנים ברקודים של גרעינים סימפתטיים של עכברים לריצוף RNA של גרעין יחיד

היכולת לסמן באופן קבוע תאי גזע וצאצאיהם באמצעות פלואורופור באמצעות קו עכברים מהונדס בלתי ניתן להשראה מאפשרת ניתוח מרחבי וזמני של הפעלה, התפשטות, נדידה ו/או התמיינות in vivo. מעקב אחר שושלת יכול לחשוף מידע חדש על מחויבות לשושלת, תגובה להתערבויות ורב-תחומיות.

מעקב אחר שושלת של תאי גזע בעלי תווית פלואורסצנטית אינדוקטיבית במוח העכבר הבוגר

מוצגת כאן שיטה לרצף גרעינים בודדים שבודדו מהפיתול המשונן של העכבר, שאינה כוללת את רוב תאי העצב באמצעות מיון גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FAN). גישה זו מייצרת פרופילי ביטוי איכותיים ומקלה על המחקר של רוב סוגי התאים האחרים המיוצגים בנישה, כולל אוכלוסיות נדירות כגון תאי גזע עצביים.

מיון שלילי של גרעינים המופעלים על ידי פלואורסצנציה של נוירונים בשילוב עם ריצוף RNA של גרעין יחיד כדי לחקור את הנישה הנוירוגנית של ההיפוקמפוס

מוצג כאן הפיתוח לרכישה עקבית של קטעי קריוסטט גנגליון שורש גבי באיכות גבוהה.

הליך עבור עכבר שורש גבי גנגליון Cryosectioning

מאמר זה מספק פרוטוקול יעיל לדיסקציה ודיסוציאציה של אפיתל הריח של עכברים לצורך ריצוף RNA חד-גרעיני.

דיסקציה ודיסוציאציה מהירה של אפיתל הריח של העכבר למתלים חד-גרעיניים

למדו לבצע דיסקציה של Stria vascularis בעכברים בוגרים לצורך ריצוף גרעין יחיד ו-immunostaining. שיטה זו מאפשרת מיפוי הנוף התעתיקי וחקר מנגנוני הליקוי בשמיעה.

דיסקציה של Stria vascularis עכבר בוגר עבור ריצוף גרעין יחיד או immunostaining

גלה סרטונים נוספים