Name: 斑马鱼鳞片再生 在多多 和 离体 鳞片培养中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 49 s
Description: 了解斑马鱼鳞片体外培养技术，用于研究骨重塑过程中成骨细胞与破骨细胞的相互作用。该方法为骨骼再生机制及衰老、昼夜节律影响提供了独特的研究模型。

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我们感谢动物服务部门的 Mathew Green 在鱼类饲养方面提供的帮助，以及沃尔夫森生物成像中心的 Katy Jepson 的支持。CLH、DB 和 QT 的研究由关节炎对抗组织资助（CLH 高级研究员项目 21937，DB 和 QT 中级研究员项目 22044）；RR 由澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC APP1158758）资助。&#160;本工作还获得了英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）基金项目（BB/T001984/1）的支持。

大学动物科学单元（ASU）在斑马鱼养殖指南的指导下负责斑马鱼的饲养管理。所有实验操作，包括鳞片采集、活体骨组织染色和活体成像，均经英国英国内政部项目许可证（PP4700996）批准并在此许可下进行。本研究使用了来自 sp7:mCherry [Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46] 品系的年轻成年转基因斑马鱼17，鱼群包含4月龄的雄性和雌性个体。
1. 在体 规模再生
<ol>
	<li>在开始鳞片再生实验之前，将斑马鱼从主饲养缸转移至单独的实验缸（参见材料表），并在整个实验过程中每次成像后将其放回相应的单独实验缸中，如图2所示。此操作旨在确保所有再生的鳞片均为实验中采集的鳞片；群体饲养可能导致因个体间相互损伤而随机脱落鳞片。 
	注意：将斑马鱼单独饲养以避免个体间打斗及由此导致的鳞片脱落。</li>
	<li>根据实验设计记录每条实验&#160;鱼的信息（即基因型、年龄和性别）。使用相机（智能手机摄像头即可）拍摄每条鱼与标尺并列的照片，以记录鱼体大小/长度及健康状况。</li>
	<li>在实验当天，通过浸入0.05%（v/v）三卡因甲烷磺酸盐（MS222，参见材料表）对斑马鱼进行麻醉，随后将其置于带有湿润纸巾的培养皿中，以避免在成像或鳞片采集过程中鱼体移动。</li>
	<li>将鱼体侧放（通常使用左侧体侧以保持一致性）。使用体视显微镜在适当放大倍数下进行体侧成像（本研究通常采用2x、4x和/或6.3x及8x放大倍数，以同时捕获整体再生区域及用于详细观察的局部放大区域）。 
	注意：体侧成像的时间点取决于实验目的及所选用的转基因报告基因。例如，若需追踪鳞片再生过程中的成骨细胞，建议的时间点为第0天（发生学阶段）、收获后第2天（dph）、第4 dph、第7 dph、第10 dph、第14 dph和第21 dph。为减少重复麻醉带来的影响，应尽量减少成像时间点的数量，仅保留实验必需的最少次数。</li>
	<li>在体视显微镜下使用精细镊子和钳子采集鳞片。将采集的鳞片转移至收集管中，用于后续鳞片染色。 
	注意：可采集的鳞片最大数量需遵循当地已批准的伦理规范。我们通常采集约20至30片鳞片，并分别收集到独立的收集管中用于后续染色，例如ALP染色、von Kossa14染色。</li>
	<li>将鳞片收集至1.5 mL或2 mL收集管中，具体选择取决于所用染色方法。
	<ol>
		<li>对于ALP染色和von Kossa染色，将鳞片转移至含有去离子水的收集管中；而对于TRAP染色或免疫组织化学染色，则将鳞片转移至含有4%多聚甲醛（PFA，固定液）的收集管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选步骤：若需要，在将鳞片转移至收集管前，拍摄单个采集鳞片的图像。 
	注意：建议的鳞片采集时间点为第0天（发生学阶段）、第10天和第21天（已再生鳞片）。</li>
</ol>
2. 活体骨染色
注意：活体骨骼染色可在实验鱼未携带荧光报告基因或仅携带单色转基因报告基因时进行。活体染色可用于补充转基因标记；例如，可使用一种成骨细胞报告基因（如 sp7/osx）以一种颜色（如 GFP）显示，再用茜素红（AR）将骨骼染成红色。茜素红与钙黄绿素绿可同时用于同一条鱼：在此情况下，茜素红通过结合老化骨骼矿化基质来标记原始或发生学骨骼，而钙黄绿素则结合新形成骨骼中丰富的钙离子。例如，在对发生学鳞片进行染色时，可观察到茜素红信号，但钙黄绿素绿信号可能缺失或极微弱，因为发生学鳞片的新骨形成水平较低。
<ol>
	<li>进行活细胞茜素红（AR）染色。
	<ol>
		<li>配制一瓶2倍浓度的AR染色液，将0.5%（w/v）的茜素储备液（10 mL）与10 mL的1 M HEPES储备液混合（终浓度为10 mM）（参见 材料表).</li>
		<li>用1x Danieau溶液定容至1 L（参见 材料表）。溶液必须避光保存或用铝箔包裹。</li>
		<li>实验当天，将500 mL的2倍浓度AR溶液带至斑马鱼养殖室，并加入500 mL系统用水（来自水族箱），配制成1倍工作浓度的AR溶液。</li>
		<li>将鱼从鱼缸中转移至1x工作浓度的AR染色液中，静置15–20分钟。用系统水清洗鱼体，去除多余染料，清洗过程持续15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行活细胞Calcein Green染色。
	<ol>
		<li>将45 mg的Calcein粉末加入900 mL的1x Danieau溶液中，配制一瓶2x Calcein Green染色液（参见 材料表使用磁力搅拌器使粉末完全溶解。</li>
		<li>将pH值调节至8。此为2倍浓度的Calcein Green储备液。溶液可避光/用铝箔包裹，在室温下保存最长1个月。</li>
		<li>实验当天，将500 mL的2x钙黄绿素绿色溶液带至斑马鱼养殖室，加入500 mL系统用水，配制成1x工作浓度的钙黄绿素绿色溶液。建议使用新鲜配制的钙黄绿素染色液。</li>
		<li>将鱼从养殖缸转移至1×工作浓度的Calcein Green染色液中，染色1–2小时。根据鱼的大小，可能需要更长的染色时间。</li>
		<li>用系统水对鱼进行15分钟的“清洗”，以洗去多余的染料。 
		注意：应尽快对钙黄绿素绿染色的鱼进行成像，因为该染料在数小时内会逐渐褪色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 收获后鳞片的碱性磷酸酶（ALP）染色
<ol>
	<li>通过将 100 mM Tris（用 HCl 调至 pH 9.5）与 100 mM NaCl 和 50 mM MgCl2 混合，配制 ALP 染色液。</li>
	<li>使用市售的 NBT/BCIP 储存液（见材料表）。</li>
	<li>将鳞片转移至含有去离子水的离心管中。</li>
	<li>用 ALP 染色液冲洗鳞片 5 分钟。</li>
	<li>同时，取 200 µL NBT/BCIP 溶液加入 10 mL ALP 染色缓冲液中，配制成工作浓度染色液。该溶液需在染色前新鲜配制。</li>
	<li>用工作浓度的 ALP 染色液对鳞片染色 15 分钟。</li>
	<li>用去离子水冲洗鳞片以终止反应。</li>
</ol>
4. 收获后鳞片的Von KOSSA染色
<ol>
	<li>配制 5% (w/v) 硝酸银溶液。</li>
	<li>配制 5% (w/v) 硫代硫酸钠溶液。</li>
	<li>将采集的鳞片转移至含有去离子水的离心管中。</li>
	<li>在强光条件下，将鳞片在硝酸银溶液中孵育 40 分钟。 
	注意：请穿戴个人防护装备（PPE），因为硝酸银会留下难以去除的污渍。</li>
	<li>用去离子水清洗鳞片两次，每次 5 分钟。 
	注意：硝酸银废液必须根据当地规定收集并妥善处理。</li>
	<li>将鳞片在硫代硫酸钠溶液中孵育 5 分钟。</li>
	<li>用去离子水清洗鳞片两次，每次 5 分钟。</li>
</ol>
5. 比色TRAP染色
注意：详细步骤请参考先前发表的研究18。
<ol>
	<li>配制染色液。
	<ol>
		<li>配制 10 mg/mL 萘酚 AS-MX 磷酸盐溶液。
		<ol>
			<li>称取 5 mg 萘酚 AS-MX 磷酸盐（见材料表）。</li>
			<li>在通风橱中，取一支离心管加入 0.5 mL N,N'-二甲基甲酰胺，将 5 mg 萘酚 AS-MX 磷酸盐溶解于 0.5 mL N,N'-二甲基甲酰胺中，配制成 10 mg/mL 的萘酚 AS-MX 磷酸盐储备液（轻轻振荡溶解）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制 1.6 mM 快速红紫 LB 储备液（溶于 50 mM 酒石酸钠溶液中）。
		<ol>
			<li>配制 50 mL 0.1 M 醋酸钠缓冲液（pH 5）：将 0.41015 g 醋酸钠溶于 50 mL 去离子水中，并用 100% 冰醋酸调节 pH 至 5。</li>
			<li>将 0.575 g 酒石酸钠二碱二水合物（见材料表）溶解于 50 mL 0.1 M 醋酸钠缓冲液（pH = 5）中。</li>
			<li>加入 30 mg 快速红紫 LB 盐。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制 PBS-0.1Tx 溶液（将 500 µL Triton-X 加入 500 mL PBS 中）。
		<ol>
			<li>配制 PBS-0.1Tw 溶液（将 500 µL Tween-20 加入 500 mL PBS 中）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制工作用 TRAP 溶液。
	<ol>
		<li>在通风橱中将上述两种储备液混合（0.5 mL 10 mg/mL 萘酚 AS-MX 磷酸盐溶液与 50 mL 1.6 mM 快速红紫 LB 储备液（溶于 50 mM 酒石酸钠））。 
		注意：混合后的染色工作液可在通风橱外使用。该溶液可避光包裹铝箔后储存于冰箱中，最长可保存一个月。应与抗体或其他对固定剂敏感的试剂分开放置。应尽可能避免光照。</li>
		<li>可选：对经 TRAP 染色后再次固定的样本，可在 PBS-0.1%Tween-20（PBS-0.1%Tw）中配制漂白液。</li>
		<li>配制终浓度为 0.5% 氢氧化钾（KOH）（由 10% w/v 储备液稀释）和 3% 过氧化氢（H2O2）（由 33% 储备液稀释，该储备液储存于冰箱中）的混合液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行样本固定。
	<ol>
		<li>将鳞片置于含 4% 多聚甲醛（PFA）的 1×PBS 中，在室温（RT）下摇动或旋转固定 40 分钟。</li>
		<li>弃去 4% PFA 溶液，用 PBS-0.1Tx 洗涤至少 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>可直接进入 TRAP 染色步骤（推荐方法），或在 PBS-0.1Tx 中于 4 °C 过夜保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对鳞片进行 TRAP 染色。
	<ol>
		<li>弃去 PBS-0.1Tx 溶液，加入显色型 TRAP 工作液（步骤 5.2.1 配制）以完全覆盖样本（例如，在 1.5 mL 微离心管中加入 1 mL 染色液）。</li>
		<li>在室温下避光摇动孵育 1–2 小时。</li>
		<li>弃去染色液，用 PBS-0.1Tw 洗涤至少 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>在室温下避光轻柔摇动，用 4% PFA 再次固定样本 30 分钟。</li>
		<li>用 PBS-0.1Tw 洗涤 3 次，每次 5 分钟，以去除 PFA 溶液。 
		注意：样本可在储存液中或封片于载玻片上，于 4 °C 避光长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 染色后鳞片的封片
<ol>
	<li>将 2.4 g Mowiol 4-88 晶体加入 6 g 甘油中以制备封片剂（见材料表）。也可使用任何其他偏好的封片剂。</li>
	<li>加入 6 mL 去离子水，并在磁力搅拌器上搅拌 1 小时。</li>
	<li>加入 12 mL 0.2 M Tris（pH 8.5），并在约 53 °C 下孵育，直至 Mowiol 晶体完全溶解。</li>
	<li>在室温下以 2000 x g 离心 20 分钟，澄清溶液。</li>
	<li>将溶液转移至储存容器中。封片剂可在冷冻条件下保存约 12 个月。解冻后的 Mowiol 溶液在 1 个月内保持稳定。</li>
	<li>将样本置于载玻片上的封片剂中，加盖盖玻片，并在显微镜下观察。</li>
</ol>
7. 离体 鳞片培养
注意：此步骤改编自 de Vrieze 等人12。
<ol>
	<li>在无菌环境中采集鳞片之前，准备好成骨培养基和培养板。
	<ol>
		<li>成骨培养基（OCM）：在无菌离心管中，用标准细胞培养基（高糖、无谷氨酰胺、无酚红）配制15 mL OCM，终浓度分别为1% 小牛血清、1%（200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽溶于0.85% NaCl）、1% 抗生素/抗真菌溶液（100倍浓度），4 mM CaCl₂，2，10 mM β-甘油磷酸钠，1 nM 丙酮酸钠和1% 两性霉素B（可选）（参见 材料表).</li>
		<li>将OCM倒入无菌试剂储液槽中，使用多通道移液器向96孔板的每个孔中加入100 µL。</li>
		<li>密封96孔板并储存。OCM可在冰箱中短期保存（过夜至1周），使用前置于28 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行鳞片采集和PBS洗涤。
	<ol>
		<li>使用无菌镊子采集鳞片，并将其放入含有无菌 PBS 溶液的培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行平板设置。
	<ol>
		<li>使用无菌镊子将每个培养皿中的鳞片转移至96孔板的各孔中，每孔加入100 µL预热至28 °C的OCM。</li>
		<li>将所有鳞片转移至孔板后，立即将孔板置于体视显微镜下。使用精细的无菌移液器吸头轻轻将每片鳞片移至孔底，并使其远离孔壁，以避免成像过程中产生光线反射。 
		注意：仅在进行活体成像时需要执行此步骤。</li>
		<li>小心地将培养板转移至培养箱或活细胞成像系统（LIS，参见 材料表）（设定为 28 °C，5% CO2），鳞片可在该条件下培养长达7天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>更换 OCM（可选）。
	<ol>
		<li>将存放在冰箱中的OCM预热至28 ˚C。</li>
		<li>将96孔板小心转移至无菌环境。使用多通道移液器从每个孔中吸取50 µL液体。操作时，将吸头紧贴孔壁，避免触及孔底，以防吸出或扰动沉淀物。不同实验条件之间需使用新的吸头。</li>
		<li>将OCM倒入无菌试剂储液槽中，使用多通道移液器向每个孔中加入60 µL OCM。</li>
		<li>将培养皿置于体视显微镜下，检查鳞片位置是否异常（如过于靠近皿壁、漂浮或在培养基中呈垂直状态）。如有需要，使用无菌的精细移液器吸头重新调整其位置。</li>
		<li>将培养皿放回培养箱/LIS。 
		注意：如果实验涉及昼夜节律（CR），请勿更换培养基，因为血清冲击可能影响生物钟。若研究昼夜节律，需注意光照条件同样会重置生物钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行培养后规模化染色与成像（可选）。
	<ol>
		<li>培养6天后，固定细胞并进行适当的染色，如上文所述的von Kossa染色和ALP染色。</li>
		<li>或者，如果实验鱼带有荧光标记，则将培养板放入活体成像系统中。 
		注意：如果使用活细胞成像系统，需确保其设定的温度和 CO₂ 浓度适合细胞生长。2 适合实验要求的水平。通常在本研究中，28 °C 和 5% CO₂2 使用了适当的滤光片和成像时间点（此处采用2或4小时的间隔，足以追踪成骨细胞的迁移），并使用低倍物镜（如4x）以确保对整个孔板进行均匀成像。这是因为样本在孔内容易移动，尤其是在更换培养基时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Harvesting and Visualization of Elasmoid Scales of Zebrafish During In Vivo Regeneration

<ol><li>Tobias, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+in+functional+genomics+research+in+osteoporosis%3A+report+from+a+workshop+held+by+the+causes+working+group+of+the+osteoporosis+and+bone+research+academy+of+the+Royal+Osteoporosis+Society+on+October+5th+2020%2C%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges in functional genomics research in osteoporosis: report from a workshop held by the causes working group of the osteoporosis and bone research academy of the Royal Osteoporosis Society on October 5th 2020,&#34;.</a> Frontiers in Endocrinology. 11, (2021).</li>
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<li>Dietrich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+biology+and+disease+modeling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Skeletal biology and disease modeling in zebrafish.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 36 (3), 436-458 (2021).</li>
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<li>Carnovali, M., Banfi, G., Mariotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+modulation+of+bone+metabolism+in+zebrafish+scales+as+new+model+of+male+osteoporosis+in+lower+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Geroscience%22%5BJournal%5D)">Age-dependent modulation of bone metabolism in zebrafish scales as new model of male osteoporosis in lower vertebrates.</a> Geroscience. 43 (2), 927-940 (2021).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

斑马鱼的盾鳞鳞片作为一种骨骼研究的新模型，在增进我们对骨维持、再生及损伤修复的理解方面具有巨大潜力。鱼类体表丰富的鳞片使得中到高通量的化合物筛选成为可能，同时减少了实验动物的使用数量，并限制了个体内的变异。本文介绍了用于研究鳞片再生与修复的鳞片再生方案及离体鳞片培养方法。
在遵循本方案时，需考虑一些关键步骤。去除鳞片时需格外小心，尤其是在使用转基因报告基因品系时，应尽量减少取样对细胞群体造成的干扰。若需与发育过程中的鳞片进行比较，应确保所选区域不含自发再生的鳞片（此类再生可能在鱼类生命周期中自然发生）。确保实验环境与设备无菌。 离体 培养以实现细胞存活率最大化并尽量减少污染。
根据具体的研究问题，可对实验方案进行调整，例如结合不同的转基因报告基因品系，以在再生和修复过程中观察其他细胞类型或基因表达谱11,14。
对鳞片可进行多种染色，这意味着针对每种测试的化合物或条件，可以从不同角度观察其对骨骼的影响；例如，sp7/osx 报告基因可显示成骨细胞数量，ALP 染色可显示成骨细胞活性，TRAP 染色可显示破骨细胞活性，钙黄绿素绿荧光活体染色可标记新形成的骨组织，而茜素红或冯·科萨染色则可显示鳞片的矿化情况。此外，也可利用荧光素酶活性定量成骨细胞12。结合这些染色技术，可明确成骨细胞与破骨细胞在特定骨效应中的相对贡献。鳞片中缺乏骨细胞，而骨细胞在哺乳动物骨骼中普遍存在，并是骨骼机械感应反应的主要驱动者；在此模型中，鳞片的修复与再生主要由成骨细胞启动，随后由破骨细胞进行重塑8,9。需要注意的是，个体之间以及不同年龄组之间存在变异20。为尽量减少此类变异，必须保持鳞片采集区域的一致性，因为不同位置可能产生形态不同的鳞片，同时应使用同窝出生的鱼类，以确保年龄和体型一致。然而，由于每条鱼可采集多个鳞片，因此可用更少的实验鱼进行更多重复实验，从而降低个体内的变异性。
总之，这些方案展示了可应用于发生中及再生鳞片的实验技术。综上所述，软骨硬鳞具有作为骨骼模型的巨大潜力，有助于理解骨形成与修复机制，并将有助于减少用于高通量促骨生成化合物筛选的动物使用量。

骨是一种坚硬的结缔组织，构成骨骼的主要部分，能够支持运动并在体内充当矿物质储备。为了维持骨骼健康，骨形成与骨降解之间的精妙平衡至关重要。 通过 成骨细胞（具有合成代谢作用）与破骨细胞（负责骨吸收）的耦联活动。这种平衡会因衰老或激素失衡而被打破，常导致骨质疏松等骨脆性疾病。1尽管已有药物获批用于治疗骨脆性相关疾病，但许多药物存在副作用，因此亟需开发新的治疗手段。1因此，仍需要大量具有生物学相关性的骨组织来源，用于测试潜在的治疗化合物。
传统上，啮齿类动物模型和细胞培养系统被用于骨骼生物学研究。然而，斑马鱼正逐渐成为另一种理想的研究模型。尽管斑马鱼并非哺乳动物系统，但在骨骼研究方面相较于啮齿类动物具有一些优势，包括其繁殖力强以及幼体具有通透性；即使在成体阶段，某些骨骼组织（如鳞片和鳍）仍保持通透性，从而允许高分辨率观察 体内 成像技术与骨骼突变体可获得性的提升2,3斑马鱼的鳍和鳞片在被移除后均能完全再生。斑马鱼鳍的骨骼再生与损伤修复已得到广泛研究。4,5，而斑马鱼鳞片是该领域较新的骨模型，但具有以下优势 离体 培养6.
鳞片数量极为丰富，每条鱼至少有300片鳞片，作为鱼类的保护性覆盖层。每一片鳞片都是一个小型矿化板，由成骨细胞（负责骨形成）和破骨细胞（负责骨吸收）构成，并嵌入富含胶原蛋白的骨骼基质中7。斑马鱼鳞片和人类骨骼的骨化过程均需要间充质干细胞分化为成骨细胞，以形成矿化基质。斑马鱼鳞片因其强大的再生能力，在骨骼研究中具有显著优势，可用于研究骨再生与修复过程。然而，尽管鳞片中含有成骨细胞和破骨细胞，却缺乏对人类骨重塑和机械感知至关重要的骨细胞；此外，由于鳞片位于体表，可用镊子轻易摘除。一旦去除鳞片，便会引发一系列级联反应，启动鳞片再生过程8,9。目前已有多种染色与成像方法可用于观察成骨细胞和破骨细胞的活性以及鳞片的矿化情况，如图1所示。此外，大量可用的荧光&#160;转基因报告品系斑马鱼使得研究人员能够在再生过程中实时观察细胞动态7,10,11。该过程有助于通过观察鱼体侧部鳞片再生的早期模式，深入理解从头&#160;骨形成过程，进而研究再生鳞片的形态学特征、细胞活动及基因表达谱。鳞片形成与再生的生物学机制已被广泛阐明。尤为重要的是，鳞片在预测具有治疗潜力的化合物方面表现出良好的能力12，而用糖皮质激素处理斑马鱼可导致其再生鳞片呈现骨质疏松表型13。再生鳞片的转录组分析显示，参与鳞片再生的激活基因在与人类骨骼疾病相关的基因中显著富集，进一步证明了其作为研究模型系统的相关性6,14。
最后，这些鳞片可以进行培养 离体 最长可达7天。与通常由单一细胞类型组成的细胞系培养相比， 离体 规模化培养提供 体外 在含有成骨细胞和破骨细胞及其天然细胞外基质的自然环境中开展骨研究的机会8,12,15,16.
规模化培养还使我们能够对新型成骨合成靶点进行药物筛选。由于鱼类体表鳞片数量丰富，仅一条鱼便可提供足够填充至少两块96孔板的鳞片，从而实现多孔板格式的化合物筛选，每个孔中均含有一枚鳞片及其天然的细胞微环境。此外，由于鳞片较薄，药物吸收具有良好的可预测性12总之，斑马鱼的盾鳞在骨骼研究中具有巨大潜力，有助于我们深入了解骨形成和修复过程中的细胞事件。本文介绍了用于采集鳞片以观察其再生过程的实验方案 体内 并培养鳞片 离体.

<table><tbody><tr><td>10倍磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>70013-016</td><td>PBS</td></tr><tr><td>12通道移液器</td><td>Sartorius</td><td>728230</td><td>多通道移液器，Proline Plus 机械移液器，12通道，10–100 &amp;micro;L&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>离心管，CentriStar 盖，聚丙烯材质，无RNA酶/DNA酶，无热原</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>茜素红</td><td>Sigma</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>ThermoFisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Bemis Parafilm M 实验室封口膜</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>11772644</td><td>密封膜</td></tr><tr><td>钙黄绿素粉末</td><td>Sigma</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Thermo Scientific</td><td>L13191.30</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96孔板</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>96孔板，透明，平底聚苯乙烯TC处理微孔板，独立包装，带盖，无菌</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Cytiva&amp;nbsp;HyClone 铁补充小牛血清</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>SH30072.03</td><td></td></tr><tr><td>Danieau溶液</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM培养基</td><td>Life Technologies</td><td>31053</td><td></td></tr><tr><td>Falcon管</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>Fast Red Violet LB 储存液</td><td>Sigma</td><td>F3381</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX补充剂</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>X</td><td></td><td>培养箱，设定为28 &amp;deg;C 和 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom</td><td>Sartorious</td><td>X</td><td>活细胞成像系统，设定为28 &amp;deg;C 和 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Leica 体视显微镜</td><td>X</td><td></td><td>体视显微镜</td></tr><tr><td>L-酒石酸二碱二水合物</td><td>Sigma</td><td>228729</td><td></td></tr><tr><td>Mgcl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>BDH 实验室用品&amp;nbsp;</td><td>261237T</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Epredia</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>9002-89-5</td><td></td></tr><tr><td>超纯水</td><td>X</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N,N&amp;rsquo;-二甲基甲酰胺（Merck：D4451）</td><td>Merck</td><td>D4451</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/3120/53</td><td></td></tr><tr><td>萘酚AS-MX磷酸盐</td><td>Merck</td><td>N4875</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP溶液</td><td>Sigma</td><td>#000000011681451001</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Corning</td><td>430589</td><td>35 mm 无菌培养皿，未经处理，无热原，聚苯乙烯材质</td></tr><tr><td>试剂储液槽</td><td>Startub</td><td>E2310-1025</td><td>25 mL 试剂储液槽</td></tr><tr><td>硝酸银</td><td>Sigma</td><td>209139</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma</td><td>52889</td><td></td></tr><tr><td>β-甘油磷酸钠五水合物</td><td>Thermo Scientific</td><td>L03425.14</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠溶液</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>酒石酸钠</td><td>Sigma</td><td>S4797</td><td></td></tr><tr><td>硫代硫酸钠</td><td>Sigma</td><td>563188</td><td></td></tr><tr><td>三卡因甲磺酸盐（MS222）</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>吐温-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20&amp;nbsp;</td><td>SLS</td><td>CHE3852</td><td></td></tr><tr><td>5号镊子</td><td>Dumont</td><td>500341</td><td>镊子，INOX材质，生物学级别</td></tr><tr><td>斑马鱼养殖缸&amp;nbsp;</td><td>Tecniplast</td><td>&amp;nbsp;ZB30BCP</td><td>3.5 L - 28 cm × 11 cm × 17 cm</td></tr><tr><td>斑马鱼养殖缸&amp;nbsp;</td><td>Tecniplast</td><td>&amp;nbsp;ZB30BCP</td><td>1 L - 28 cm × 7 cm × 11 cm</td></tr></tbody></table>

斑马鱼鳞片再生 整体上 和 离体 鳞片培养

Zebrafish Scale Regeneration In Toto and Ex Vivo Culture of Scales

骨骼疾病通常病因复杂，影响全球数百万人。随着人口老龄化，亟需开发新的治疗方法，以减轻医疗系统的负担。由于这些疾病具有复杂性，在实验室环境中准确模拟其骨病理生理过程既困难又昂贵。该领域的挑战在于建立一种经济高效且具有生物学相关性的骨病建模平台，可用于筛选潜在的治疗化合物。理想的平台应能够动态观察成骨细胞（负责骨形成）和破骨细胞（负责骨吸收）在其矿化基质环境中的细胞行为。斑马鱼因其丰富的遗传工具（包括转基因报告品系）以及部分骨骼组织（如鳞片）在成体阶段仍保持透明性，从而支持动态成像，正被越来越多地用作研究模型。斑马鱼鳞片含有成骨细胞和破骨细胞，且数量丰富，可作为易于获取且充足的独立骨单位资源。此外，成体斑马鱼鳞片在移除后能够完全再生，因此为研究矿化组织的时空生长过程提供了有效途径 体内 在此，我们详细描述了鳞片的收获及再生追踪的实验方案。最后，提供了鳞片稳定培养的实验方案 离体 为期一周，并展示了对鳞片矿化基质进行可控损伤后，随时间推移的愈合反应。

鳞片再生 
可以使用标准荧光体视显微镜对斑马鱼体侧进行成像，以追踪鳞片再生过程。 图 3A 显示变化 sp7/osx 4月龄斑马鱼鳞片再生过程中鳞片的表达。 flank成像的时间点如图所示 图3A 分别为发育阶段（收获前的原始鳞片）、收获后第2天、第4天和第10天。我们通常使用 osx （也称为 Osterix 或 sp7) 转基因品系（作为GFP（Tg(Ola.sp7:NLS-eGFP)19 或 mCherry Tg(osterix:mCherry-NTR)pd46)17 通过标记成骨细胞以追踪骨骼系统的变化。在再生第2天即可观察到新形成鳞片的早期模式。这种鳞片再生的早期模式在某些情况下会被破坏，尤其是在骨骼突变体中。通过追踪再生过程的进展，可以分析再生的能力与速率。在鳞片采集当天，可在体侧成像后使用同一台体视显微镜对采集的鳞片进行个体成像，如图所示。 图3B再生鳞片具有更高的 osx 与第0天的发育鳞片相比，成骨细胞的表达量升高，因为成骨细胞是新骨形成所必需的。
ex vivo 体外培养 
尽管可以通过追踪鱼类体侧的再生过程来研究新骨形成，但也可以通过在鳞片上用手术刀制造损伤，利用ex vivo鳞片体外培养模型来研究骨骼损伤的修复与愈合过程。使用活体成像系统，可实时监测损伤修复过程。图4展示了在培养3天后，发育中鳞片上损伤修复反应的代表性结果，其中成骨细胞通过osx:mCherry进行标记。培养初期插图所示的损伤部位可见成骨细胞与鳞片同心环之间存在明显间隙（图4A）。通过延时成像，可观察到成骨细胞随时间向损伤部位迁移的过程。培养3天后，间隙宽度减小，在间隙处及新形成的鳞片同心环之间可观察到osx的表达（图4B）。此外，成骨细胞的形态在培养初期呈较圆形，而培养3天后则变得更细长。这种成骨细胞形态的变化可能是由于其处于体外培养环境，而非自然状态（附着于鱼体）所致。
<img alt="使用osx:mCherry、AR、Calcein、ALP、TRAP、Von Kossa进行骨组织分析；显微镜示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65396/65396fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：鳞片成像选项示例。 成骨细胞可通过osx/sp7转基因报告基因系（GFP或mCherry）进行可视化。ALP染色可用于显示成骨细胞活性。TRAP染色可用于显示破骨细胞活性。茜素红（AR）和钙黄绿素绿色荧光染料均可用于活体鱼类；AR标记矿化区域，钙黄绿素标记新形成的骨组织。矿化的程度也可通过冯库萨（von Kossa）染色显示。比例尺：500 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65396/65396fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="斑马鱼活体成像示意图；用于时间点数据采集和鳞片采集的实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65396/65396fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：鳞片再生实验的示意图。 鳞片再生实验的通用示意图，显示实验前将鱼分至单独的养殖缸中。记录鱼的体长、性别和健康状况。示意图还显示了建议的取鳞部位（鱼体侧部）以及推荐的成像时间点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65396/65396fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="成体发育与成骨细胞发育，显微镜图像显示2、4、10天时osx标记的荧光。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65396/65396fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：斑马鱼成骨细胞标志物osterix表达的代表性图像（用于可视化成骨细胞），取自4月龄斑马鱼的鳞片再生过程。（A）在0天（采样前，成体鳞片）、2 dph（采样后天数）、4 dph和10 dph采集的体侧图像，用于追踪osx表达的变化。比例尺：1 mm。（B）来自与（A）相同个体的成体鳞片及10 dph再生鳞片的代表性图像。注意再生鳞片中心区域紫红色信号显示osx表达水平升高。比例尺：500 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65396/65396fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显微图像分析显示损伤组织在三天内的恢复情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65396/65396fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：利用活体成像系统捕获的4月龄斑马鱼在个体发育尺度上骨骼损伤修复反应的代表性结果。（A）个体发育鳞片，于培养当天用手术刀造成损伤（采集时间点0/第0天）。（B）同一片鳞片在损伤后3天的图像。插图为损伤区域。比例尺：500 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65396/65396fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本方案描述了斑马鱼硬鳞的收获与可视化方法 体内 再生。此外， 离体 展示这些鳞片在收获后长达7天的培养方法。

骨骼疾病通常病因复杂，影响全球数百万人。由于人口老龄化，迫切需要开发新的...

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

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