Cuantificación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en un modelo de esferoide tumoral: aplicación para el descubrimiento de fármacos

Una de las terapias dirigidas contra el cáncer más eficaces se basa en anticuerpos como el anticuerpo anti-HER2 trastuzumab. La acción anticancerígena del trastuzumab implica la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos, ADCC, por células asesinas naturales o NK. La comprensión de los mecanismos que regulan la sensibilidad de las células cancerosas a la terapia con anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento, con especial atención a la ADCC, podría ser crucial para el desarrollo de modalidades de tratamiento novedosas y más eficientes.

Los modelos 3D, como los esferoides de células cancerosas, demostraron ser superiores en la predicción de las respuestas inmunitarias de los tumores a diversas terapias contra el cáncer. Por lo tanto, establecimos un modelo de esferoide ADCC utilizando la línea de células asesinas naturales NK92, células de carcinoma de mama JIMT-1 que expresan GFP y trastuzumab. Configuramos el sistema de ensayo ADCC induciendo las células de carcinoma de mama anti-HER2 positivo JIMT-1 para formar grupos tridimensionales llamados esferoides.

La línea celular JIMT-1 utilizada en los experimentos expresa de forma estable la proteína verde fluorescente. Comenzamos el experimento preparando la placa de 96 pocillos para la formación de esferoides. Para crear un fondo en forma de U y repelente a las células, cubra la placa de 96 pocillos con una solución de agarosa al 0,5% en PBS.

Incube la placa a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 a 45 minutos. Mientras tanto, la tripsinización y el recuento de células JIMT-1 para la siembra celular. Lavar las células con dos mililitros de PBS estéril.

Agregue dos mililitros de tripsina-EDTA al matraz y vuelva a colocar el matraz en una incubadora de CO2 durante 10 minutos. Después de la incubación, golpee el matraz para comprobar si las células JIMT-1 se han desprendido. Detenga la digestión con dos mililitros de medio JIMT-1 y recoja la suspensión celular en un tubo de 50 mililitros.

Cuente las células con azul de tripano en una cámara Burker y ajuste el número de células a 20.000 células por ml. Siembre las células en la placa de 96 pocillos pipeteando 100 microlitros de suspensión celular en cada pocillo para la formación de esferoides. Deje que las células se agrupen durante el tiempo de incubación de tres días a 37 grados en una incubadora de CO2.

Compruebe el tamaño y la forma de los esferoides regularmente con un microscopio invertido. En el tercer día después de la inducción de esferoides, recubra la placa de cribado de alto contenido de 96 pocillos con una solución de Pluronic F-127 en DMSO. El recubrimiento es crucial para evitar la adhesión de esferoides JIMT-1 EGFP a la superficie del vidrio o a la placa.

Después de un período de incubación de 45 minutos a temperatura ambiente, aspire la solución de recubrimiento y lave los pocillos dos veces con medios sin suero DMEM F12. Transfiera los esferoides a la placa de cribado de alto contenido de 96 pocillos por triplicado con una pipeta de un mililitro. Agregue sunitinib a los pocillos a la concentración de 40 micromolares en 10 microlitros por pocillo y pipetee medios JIMT-1 frescos a los pocillos de control para aumentar el volumen.

Incubar la placa durante una hora en una incubadora de CO2 a 37 grados. Mientras se lleva a cabo la incubación de los esferoides pretratados, recoja las células NK92 del matraz en un tubo de 15 mililitros. Cuente las células con azul de tripano en una cámara Burker y ajuste el número de células para alcanzar una relación efectora-objetivo de 20 a 1.

Tiña las células NK con una solución de 10 micromolares de CellTracker Blue y colócalas en una incubadora de CO2 durante una hora a 37 grados. Para lavar el exceso de colorante, centrifugue las células NK dos veces a 150 RCF durante tres minutos a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a suspender las células en un medio JIMT-1 nuevo.

Agregue las células NK teñidas a los esferoides JIMT-1 EGFP objetivo pipeteando 55 microlitros por pocillo junto con el anticuerpo anti-HER2 trastuzumab. Diluir trastuzumab en medios JIMT-1 hasta alcanzar una concentración de 10 microgramos por ml. Agregue los 110 microlitros de medios JIMT-1 frescos a los pocillos de control e incube la placa durante 24 horas en una incubadora de CO2 a 37 grados.

Como resultado, el volumen total de tratamiento agregado para el ADCC es de 110 microlitros y la concentración final de sunitinib es de 20 micromoles por litro. Para detectar y medir la muerte celular apoptótica después de los tratamientos, tiñir los esferoides con un conjugado de anexina V Alexa Fluor 647 durante una hora en medio JIMT-1. Una vez finalizados los pasos experimentales, transfiera la placa al dispositivo de análisis de alto contenido.

La imagen de la placa se obtiene 24 horas después de la adición de los factores NK a las células diana. Para la obtención de imágenes, utilizamos el analizador de alto contenido y un software de análisis de imágenes. Seleccione el tipo de microplaca de la lista de placas utilizando la opción Tipo de placa.

Utilice una placa de cribado de alto contenido de 96 pocillos. Seleccione el enfoque automático de dos picos como los ensayos realizados en placas con objetivo de 10x con apertura numérica de 0,3, utilizando las opciones de enfoque automático y objetivo respectivamente. Elija el modo Confocal con la opción OptiMode y aplique la agrupación 2 a la opción Agrupación.

Para obtener imágenes de esferoides, seleccione los canales apropiados mediante la opción Selección de canal. Para detectar las células JIMT-1 transfundidas por EGFP, elija EGFP con un tiempo de integración de 200 milisegundos, 50 % de potencia láser, altura de pila de dos micrómetros, excitación de 488 nanómetros y longitudes de onda de emisión de 500 y 550 nanómetros. Y para detectar células apoptóticas, use Alexa 647 con un tiempo de integración de 100 milisegundos, 50% de potencia láser, altura de pila de 10 micrómetros, excitación de 640 nanómetros, longitudes de onda de emisión de 650 y 760 nanómetros.

Para visualizar las células NK dentro de los esferoides, elija el siguiente canal, DAPI con tiempo de integración de 100 milisegundos, 50% de potencia láser, altura de pila de dos micrómetros, excitación de 405 nanómetros y longitud de onda de emisión de 435 y 418 nanómetros. En la opción Selección de diseño, seleccione pilas Z, ya que las células de los esferoides tienden a estar en diferentes planos focales del microscopio. 10 planos con una distancia de 10 micrómetros son suficientes para cubrir toda la región esferoide.

Establezca los valores del primer plano y del último plano en 0 micrómetros y 90 micrómetros, respectivamente. Antes de iniciar la medición, se pueden tomar imágenes de muestra con la función Snapshot para comprobar los ajustes correctos. Establezca el número de pozos y campos para la obtención de imágenes mediante la opción Diseño definido.

Identifique los esferoides por la fluorescencia EGFP o las células JIMT-1 utilizando la opción Región de textura fina y fíltrelos por tamaño. Elimine los objetos de borde mediante el módulo Seleccionar población. Dado que las células positivas para anexina aparecen en los esferoides periféricos, mida la intensidad de la anexina en el anillo apoptótico.

En el módulo Seleccionar región, establezca el borde exterior en menos 90. Exprese los valores de intensidad de la anexina como intensidad media. Como lo indica la tinción con anexina V, la adición de células NK y trastuzumab a las células JIMT-1 causó muerte celular en los esferoides tumorales.

Las células apoptóticas anexinas positivas emergieron en la zona periférica de los esferoides. Sin embargo, en ausencia de trastuzumab, las células NK no desencadenaron la apoptosis de las células tumorales. Para distinguir entre los efectos directos o mediados por ADCC de trastuzumab, en este estudio se utilizó trastuzumab-Fab2 sin capacidad de unión a la región FC como control negativo.

Dado que trastuzumab-Fab2 fue ineficaz en este modelo, es probable que la muerte de las células tumorales esté mediada por ADCC. Además, el pretratamiento con sunitinib redujo la tinción de anexina V en los esferoides, confirmando la resistencia a ADCC inducida por sunitinib y revelando la prevención de la muerte celular apoptótica en esferoides JIMT-1 co-incubados con células NK y trastuzumab. Estos datos confirmaron el efecto citoprotector de sunitinib en el modelo ADCC e instan a la precaución con respecto a las posibles combinaciones de inmunoterapias basadas en ADCC y sunitinib.

En resumen, nuestro ensayo HCS podría ser adecuado para la identificación de compuestos potenciadores de ADCC.