Name: Test di aspirazione con micropipetta a fluorescenza per studiare il meccanorilevamento dei globuli rossi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Scopri la tecnica di aspirazione con micropipetta a fluorescenza per studiare il meccanorilevamento nei globuli rossi. Questo metodo rivela come l'aumento della pressione influenzi l'influsso di ioni calcio nelle cellule.

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Ringraziamo Nurul Aisha Zainal Abidin e Laura Moldovan per il reclutamento di donatori, la raccolta del sangue e il supporto alla flebotomia. Ringraziamo Tomas Anderson e Arian Nasser per aver organizzato l'attrezzatura e i reagenti. Questa ricerca è stata finanziata dall'Australian Research Council (ARC) Discovery Project (DP200101970-L. A.J.); il National Health and Medical Research Council (NHMRC) dell'Australia Ideas Grant (APP2003904-L. A.J.); Sovvenzione per attrezzature NHMRC-L.A.J.; Programma di sviluppo delle capacità cardiovascolari del NSW (Early-Mid Career Researcher Grant-L.A.J.); Sovvenzione per l'innovazione nella ricerca NSW CVRN-VCCRI; Ufficio per l'impegno globale e della ricerca (Sydney-Glasgow Partnership Collaboration Award-L.A.J.); L.A.J. è un Future Leader Fellow della National Heart Foundation di livello 2 (105863) e un borsista della Snow Medical Research Foundation (2022SF176).

Questo protocollo segue le linee guida ed è stato approvato dal Comitato Etico per la Ricerca Umana dell'Università di Sydney. Il consenso informato è stato ottenuto dai donatori per questo studio.
1. Isolamento dei globuli rossi umani
NOTA: La fase 1.1 deve essere eseguita da un flebotomo addestrato utilizzando un protocollo approvato dall'Institutional Review Board.
<ol><li>Prelevare 5 ml di sangue dalla vena cubitale mediana utilizzando un ago a farfalla da 19 G.</li>
	<li>Trasferire il sangue raccolto in una provetta da 15 mL contenente enoxaparina 1:200 per prevenire la coagulazione.</li>
	<li>Diluire 5 μL di sangue anticoagulato con enoxaparina in 1 mL di tampone carbonato/bicarbonato (tampone C, pH = 8,5-9; Tabella dei materiali).</li>
	<li>Centrifugare il campione di sangue diluito a 900 × g per 1 minuto per sedimentare i globuli rossi. Decantare con cura il surnatante senza disturbare il pellet.</li>
	<li>Eseguire due lavaggi del pellet RBC con 1 mL di tampone C (Tabella dei materiali), centrifugando ogni volta a 900 × g per 1 min.</li>
	<li>Successivamente, lavare il pellet di globuli rossi 2 volte con 1 mL di tampone di Tyrode utilizzando le stesse condizioni di centrifugazione e quindi risospendere il pellet finale in 1 mL di tampone di Tyrode per ottenere la sospensione di globuli rossi lavata.</li>
</ol>2. Caricamento dell'indicatore di calcio
<ol><li>Regolare la concentrazione della soluzione madre di globuli rossi lavata a 10 × 106 cellule/mL nel tampone di Tyrode, in base alla conta delle cellule ottenuta utilizzando un contatore automatico di cellule (Table of Materials).</li>
	<li>Etichettare il calcio all'interno dei globuli rossi incubando con 16,67 μM Cal-520 AM, un colorante sensibile al calcio, agitando su un miscelatore a tubo rotante per 1 ora.</li>
	<li>Diluire i globuli rossi nel tampone di Tyrode contenente lo 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) in un rapporto 1:50. Le celle sono ora pronte per l'uso sperimentale.</li>
</ol>3. Fabbricazione di micropipette
<ol><li>Montare il tubo capillare in vetro borosilicato (1 mm di diametro esterno x 0,6 mm di diametro interno) sull'estrattore per micropipette P-1000 per produrre due micropipette corrispondenti con puntali chiusi nel sito di estrazione utilizzando il programma di estrazione preimpostato. Per questa configurazione, utilizzare i seguenti valori del programma di trazione: calore 516, tiro 150, velocità 75, tempo 250 e pressione 500. NOTA: I parametri di riscaldamento e trazione impostati nel programma di trazione possono essere personalizzati e dipendono dalle impostazioni desiderate del disegno sperimentale12. CHECKPOINT (cfr. tabella supplementare S1).</li>
	<li>Aprire il puntale chiuso montando una delle micropipette chiuse acquistate dopo aver tirato la taglierina per micropipette. Regolare la temperatura di riscaldamento a circa 50-60 °C.</li>
	<li>Individuare la micropipetta utilizzando un oculare 10x. Avvicinare la micropipetta alla micropipetta utilizzando le manopole per la regolazione.</li>
	<li>Cambiare l'oculare a 30x prima di posizionare la micropipetta il più vicino possibile alla perla di vetro borosilicato senza piegare la punta della pipetta.</li>
	<li>Ammorbidire la perla di vetro borosilicato usando il calore premendo il pedale del riscaldamento. Inserire delicatamente il puntale della micropipetta grezzo chiuso nel cordone ammorbidito fino a raggiungere il punto finale desiderato, il diametro di apertura.</li>
	<li>Rilasciare il pedale e lasciare raffreddare la perla di vetro. Assicurarsi che la punta della micropipetta rimanga sempre all'interno del micromicrotubo. NOTA: L'ulteriore inserimento della punta porta a diametri di apertura maggiori.</li>
	<li>Estrarre delicatamente la micropipetta, ottenendo un taglio netto e dritto sulla micropipetta chiusa. Verificare che il diametro finale del capillare sia di 1 μm. NOTA: CHECKPOINT (vedere la Tabella supplementare S1)</li>
</ol>4. Preparazione della camera cellulare
<ol><li>Usa una matita diamantata per dividere un vetrino coprioggetti standard di 40 mm x 22 mm x 0,17 mm in tre strisce uguali.</li>
	<li>Incollare un pezzo del vetrino coprioggetti tagliato sul fondo di un supporto per camera fatto in casa con grasso sottovuoto. NOTA: Il supporto della camera è costituito da due quadrati di metallo (rame/alluminio) collegati da una maniglia curva. La distanza tra i blocchi metallici deve essere inferiore a 40 mm affinché il vetrino coprioggetto tagliato aderisca al supporto per formare una camera parallela.</li>
	<li>Far aderire il secondo pezzo del vetrino coprioggetti tagliato alla parte superiore del supporto della camera fatto in casa con grasso sottovuoto. NOTA: CHECKPOINT (vedere la Tabella supplementare S1)</li>
	<li>Iniettare 200 μL della sospensione di globuli rossi marcata tra due vetrini coprioggetti utilizzando una pistola per pipette da 200 μL (Figura 1).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig01.jpg"> Figura 1: Illustrazione della camera cellulare. Due pezzi tagliati di un vetrino coprioggetto di 40 mm x 22 mm x 0,17 mm vengono incollati al supporto della camera con grasso. Tra i due vetrini coprioggetti tagliati, vengono seminati circa 200 μL della soluzione cellulare nel tampone di Tyrode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
5. Gruppo di aspirazione della micropipetta
<ol><li>Montare la camera cellulare sul tavolino di supporto presente sulla piattaforma del microscopio. Regolare la posizione in modo che la camera della cella si trovi direttamente sopra l'obiettivo (Figura 2B).</li>
	<li>Abbassare il supporto della micropipetta al di sotto del livello del fluido del serbatoio dell'acqua collegato.</li>
	<li>Iniettare acqua demineralizzata o tampone Tyrode nella micropipetta fabbricata e rimuovere con cautela tutte le bolle d'aria utilizzando una siringa accoppiata con un ago da 34 G (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Svitare l'estremità del supporto della micropipetta a metà e lasciare gocciolare l'acqua dal supporto della micropipetta per alcuni secondi. NOTA: CHECKPOINT (vedere la Tabella supplementare S1)</li>
	<li>Inserire la micropipetta nel puntale di supporto. Serrare la vite di supporto per assicurarsi che la micropipetta sia fissata.</li>
	<li>Inserire la micropipetta nella camera cellulare e posizionare la micropipetta e i globuli rossi sotto il microscopio. Utilizzare il micromanipolatore per regolare la posizione.</li>
	<li>Abbassare ulteriormente il puntale della micropipetta per assicurarsi che il puntale sia livellato con il globulo rosso localizzato. NOTA: CHECKPOINT (vedere la Tabella supplementare S1)</li>
	<li>Azzerare la pressione idraulica sul puntale della micropipetta regolando l'altezza del serbatoio dell'acqua. Quindi, sollevare leggermente il serbatoio dell'acqua per generare una leggera pressione positiva sulla punta.</li>
</ol>6. Eseguire il test di aspirazione con micropipetta accoppiata a fluorescenza
<ol><li>Accendere la sorgente luminosa di eccitazione fluorescente da 488 nm. Non accendere l'otturatore a fluorescenza in questa fase per evitare il fotosbiancamento (Figura 2C). Accendere la telecamera a fluorescenza e la telecamera trasmessa. NOTA: Entrambe le fotocamere vengono utilizzate utilizzando il software appropriato (vedere la Tabella dei materiali).</li>
	<li>Impostare il tempo di esposizione desiderato (100 ms per entrambe le fotocamere in questo studio), la regione di interesse (ROI), la dimensione del binning (nessuna per questo studio) per entrambe le fotocamere nel software. Aprire il pannello di acquisizione multidimensionale per impostare il numero di frame di acquisizione, 2.000 per lo studio, e la directory di salvataggio. NOTA: Il numero di fotogramma di ripresa dipende dal numero desiderato di eventi di aspirazione che devono essere registrati. Per 1 evento di aspirazione, l'intervallo del numero di acquisizione deve essere impostato tra 100-500, che è circa 10-50 s.</li>
	<li>Trova la micropipetta sotto il campo visivo utilizzando il micromanipolatore.</li>
	<li>Accendere la pinza a pressione pneumatica, compresa la scatola di controllo e il sistema di bloccaggio (Figura 2A). Assicurarsi che la scatola di controllo sia in modalità EXTRNL. Compensare l'eventuale pressione di offset all'interno del sistema ruotando lentamente la manopola.</li>
	<li>Attivare il software separato che controlla la morsa pneumatica. Il software dispone di un pannello di controllo elettrico per controllare l'ingresso analogico discreto al sistema di morsetto. La pressione è controllata con un fattore di conversione di 20 mV/mmHg.</li>
	<li>Azzerare la pressione all'interno del sistema. Riposizionare con cautela la micropipetta vicino ai globuli rossi. Regolare la posizione del serbatoio dell'acqua fino a quando non si nota una leggera pressione positiva sulla punta della micropipetta.</li>
	<li>Avviare l'acquisizione nel software operativo della telecamera. Accendere l'otturatore a fluorescenza.</li>
	<li>Aspirare un globulo rosso digitando l'entità della tensione calcolata nel pannello di controllo per raggiungere la pressione desiderata. NOTA: La pressione per l'aspirazione di un globulo rosso è tipicamente compresa tra Δp = da -5 a -40 mmHg. Dovrebbe esserci un notevole allungamento della lingua all'interno del puntale della micropipetta (Figura 2D).</li>
	<li>Mantenere la pressione per un periodo prestabilito; Quindi, rilascia la pressione.</li>
	<li>Muovi la micropipetta per prelevare la cellula successiva e ripeti l'esperimento.</li>
</ol>7. Analisi dell'intensità della fluorescenza
<ol><li>Caricare le immagini di fluorescenza salvate nel software di analisi.</li>
	<li>Regolare la soglia di intensità utilizzando la scheda di regolazione del display . A tale scopo, immettere manualmente i valori o utilizzare il dispositivo di scorrimento per garantire che le immagini a fluorescenza mostrino un chiaro contrasto della cella nel software di analisi (vedere File supplementare 1-Figura supplementare S1).</li>
	<li>Scorri fino alla timeline nella parte inferiore del software. Individua l'evento di aspirazione designato.</li>
	<li>Fate clic su Aggiungi nuove superfici (Add new surfaces). Definire il ROI dell'analisi. NOTA: Il software fornisce un processo guidato in cinque fasi per regolare e completare la segmentazione (vedere File supplementare 1-Figura supplementare S2 e Figura supplementare S3). NOTA: mantenere il ROI il più piccolo possibile per risparmiare risorse computazionali.</li>
	<li>Utilizza il cursore di sottrazione dello sfondo e regola la soglia di segmentazione utilizzando il cursore per ottenere il miglior risultato di segmentazione. NOTA: Ciò significa che, a parte l'evento di aspirazione, lo sfondo deve essere segmentato nel modo più accurato possibile (vedere File supplementare 1 - Figura supplementare S4 e Figura supplementare S5).</li>
	<li>Aggiungere un filtro di area per escludere i rumori di fondo (vedere File supplementare 1-Figura supplementare S6). NOTA: Questa operazione viene completata nella fase di post-elaborazione.</li>
	<li>Selezionare la scheda Statistiche | Scheda Dettagli | Scheda Valori medi . Scorrere per trovare e selezionare la media dell'intensità (vedere File supplementare 1-Figura supplementare S7).</li>
	<li>Esportare la traccia del segnale di fluorescenza nel tempo in un file .csv.</li>
	<li>Apri il file csv esportato. Sottrarre i segnali di fondo, Fb, da tutte le misurazioni.</li>
	<li>Calcolare la variazione dell'intensità del calcio, ΔFmax, utilizzando l'equazione (1): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66265/66265eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) Dove ΔFmax è la variazione massima dell'intensità del calcio, Fb, è l'intensità di fondo e F0 è l'intensità a riposo.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig02.jpg"> Figura 2: Gruppo di aspirazione della micropipetta accoppiata a fluorescenza. (A) Una panoramica del sistema hardware fMPA che incorpora il microscopio invertito combinato con le telecamere in campo chiaro e a fluorescenza. Il lato sinistro dell'immagine raffigura il manometro dell'acqua fatto in casa e la scatola di controllo che permette di regolare con precisione la pressione della pompa pneumatica a pressione. (B) Il tavolino del microscopio che raffigura la camera cellulare dell'esperimento e il sistema di micromanipolatori con una singola micropipetta. (C) Schema della configurazione del sistema fMPA. Imaging simultaneo di segnali in campo chiaro (giallo) e fluorescenza (emissione blu, eccitazione verde) utilizzando due specchi dicroici per dirigere i percorsi luminosi dalla sorgente luminosa a fluorescenza (blu) al bersaglio, quindi alle telecamere per l'imaging (verde). (D) La riga superiore rappresenta le immagini in campo chiaro, mentre la riga inferiore mostra le immagini a fluorescenza. La parte sinistra rappresenta la posizione della micropipetta prima dell'aspirazione quando i globuli rossi sono a riposo. La colonna centrale mostra il processo di aspirazione in cui il globulo rosso subisce una pressione negativa di -40 mmHg. A destra è raffigurata la morfologia della cellula dopo aver sperimentato la pressione negativa di aspirazione. Barra della scala = 5 μm. Abbreviazioni: fMPA = Fluorescence-coupled Micropipette Aspiration; DM = specchio dicroico; RBC = globuli rossi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Meccanobiologia a cellula singola mediante aspirazione con micropipette a fluorescenza

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi contrastanti da riferire in merito al presente studio.

I saggi di aspirazione con micropipette incarnano una metodologia raffinata, che impiega una sostanziale modulazione della pressione, un'esatta orchestrazione spaziale e un discernimento temporale affidabile per sondare le profonde complessità della biomeccanica cellulare. Questo studio pone particolare enfasi sull'applicazione della fMPA come strumento cruciale per svelare le risposte meccanosensibili sfumate mostrate dai globuli rossi sotto stimoli variabili. L'uso simultaneo di segnali in campo chiaro e fluorescenza ha permesso un'esplorazione multiforme dei fenomeni cellulari, facendo progredire il monitoraggio e la rilevazione dell'afflusso intracellulare di calcio in tempo reale. Questo approccio fornisce una visione integrativa delle complesse reazioni di meccanorilevamento dei globuli rossi.
È importante sottolineare che l'applicabilità della tecnica fMPA si estende oltre i globuli rossi, in quanto può essere impiegata con altri tipi di cellule che disapplicano un'elevata sensibilità meccanica, come le piastrine e i neuroni9. Inoltre, grazie al suo impatto minimo sull'integrità cellulare durante la manipolazione sperimentale, l'fMPA garantisce la conservazione dello stato naturale della cellula, rendendola altamente adatta all'uso con cellule primarie1. Inoltre, il metodo fMPA offre versatilità grazie alla geometria sintonizzabile delle micropipette, consentendo una gamma più ampia di disegni sperimentali su misura per specifiche domande di ricerca e l'esplorazione efficace di varie condizioni meccaniche.
Inoltre, con il miglioramento del percorso ottico che migliora l'uso simultaneo dell'imaging multifluorescenza, il sistema fMPA consente il rilevamento in tempo reale della concentrazione intracellulare di calcio al momento dell'aspirazione. Questa capacità offre l'opportunità di esplorare molecole correlate al calcio, come il canale ionico meccanosensibile, PIEZO1, che ha dimostrato di mediare e percepire segnali meccanici provenienti dall'ambiente esterno 7,14. La letteratura recente evidenzia un aumento della tensione di membrana come fattore significativo che stimola l'attività del canale PIEZO1, facilitando successivamente l'afflusso di Ca2+ 6. Ciò sottolinea un'applicazione cruciale dell'fMPA, che consiste nello studiare l'interazione tra la tensione di membrana, PIEZO1 e l'afflusso di calcio, facendo luce sugli intricati processi di meccanorilevamento all'interno delle cellule.
Da un punto di vista tecnico, vale la pena ricordare che i due componenti principali del sistema fMPA, responsabili della generazione della forza di aspirazione (stimoli meccanici) e della conduzione dell'imaging a fluorescenza in tempo reale, sono rispettivamente la pompa a pressione pneumatica e la telecamera a fluorescenza. La scelta della pompa e della telecamera appropriate per il sistema deve essere basata sul tipo di cellula specifico e sul processo biologico oggetto di studio. La pompa impiegata nel nostro sistema opera in un intervallo di pressione stazionario di ± 200 mmHg e può rispondere a comandi per variazioni di pressione significative fino ± 200 mmHg. Il tempo di aumento e il tempo di caduta della pressione non devono superare i 6-8 ms per un passo di 20 mmHg e i 15-20 ms per un passo di 200 mmHg. Per garantire la risoluzione della forza, il livello di rumore del sistema HSPC deve essere inferiore a ± 0,5 mmHg, da picco a picco. Questi requisiti vengono applicati in questa configurazione; tuttavia, un intervallo di ± 40 mmHg è sufficiente per ottenere una risposta per il protocollo sperimentale15. Per quanto riguarda la fotocamera a fluorescenza, abbiamo selezionato un'efficienza quantica del 95% e un chip di dimensioni pixel da 11 μm x 11 μm. Questa configurazione sensibile del sensore cattura in modo efficiente il segnale di fluorescenza ad alta velocità. Inoltre, è fondamentale mantenere un rumore di lettura mediano di 1,6e- per un adeguato rapporto segnale/rumore durante l'imaging16.
Da un punto di vista procedurale, l'esecuzione di fMPA richiede una serie di competenze avanzate. Ad esempio, la realizzazione di micropipette con il taglierino per micropipette richiede precisione e destrezza, oltre a un controllo meticoloso della temperatura e del posizionamento. Il posizionamento della micropipetta all'interno del campo visivo del microscopio richiede uno sforzo meticoloso per evitare danni sia alla punta della micropipetta che alla camera cellulare. Inoltre, una sfida comune associata all'imaging a fluorescenza è il fotosbiancamento. Per mitigare questo problema, è importante ridurre al minimo il tempo di esposizione del campione al sistema di illuminazione. Con riferimento al protocollo "saggio di aspirazione con micropipette accoppiate a fluorescenza", l'otturatore di fluorescenza della sorgente luminosa di eccitazione rimane spento fino a quando tutti i parametri non vengono inseriti tramite il software operativo della telecamera e il sistema di aspirazione è pronto per gli esperimenti. Solo allora l'otturatore a fluorescenza viene attivato per iniziare l'imaging. Per ridurre ulteriormente il fotosbiancamento, si consiglia di utilizzare l'intensità minima della sorgente luminosa che produca comunque un'adeguata espressione di fluorescenza nel campione.
Inoltre, l'attuale operazione manuale richiesta per i saggi fMPA rende questa tecnica laboriosa. Di conseguenza, le incongruenze che possono sorgere in questo test derivano principalmente da variabili dipendenti dall'operatore, nonché dai fattori associati alle variazioni nel preriscaldamento del filamento e nelle caratteristiche del vetro capillare. In futuro, l'ottimizzazione delle prestazioni di questa tecnica richiederà la considerazione di potenziali implementazioni in tandem. Ad esempio, se combinata con dispositivi microfluidici, l'aspirazione della micropipetta può essere trasformata in una piattaforma ad alto rendimento, aumentando significativamente la velocità sperimentale dallo studio di circa 20 cellule all'ora a circa 1.000 cellule/h17,18. Questa incorporazione migliora anche la riproducibilità dei dati. Inoltre, alcune strade sono state esplorate con successo incorporando sistemi di automazione e di analisi delle immagini19. In particolare, l'analisi agli elementi finiti (FEA) è uno strumento computazionale comunemente impiegato per modellare i saggi di aspirazione delle micropipette. La FEA è in grado di predire la risposta cellulare agli stimoli meccanici e di caratterizzarne le proprietà meccaniche. Ha il potenziale per ottimizzare il design della micropipetta e convalidare ulteriormente i risultati sperimentali19.
In conclusione, l'approccio fMPA offre preziose informazioni sui comportamenti meccanosensibili dei globuli rossi nel rispondere a stimoli meccanici. Questo studio stabilisce un quadro fondamentale per le future indagini sugli intricati meccanismi di meccanotrasduzione all'interno dei globuli rossi e in sistemi biologici più ampi. Tali indagini sono molto promettenti per far progredire la nostra comprensione di questi meccanismi e svelare le loro ampie implicazioni in vari contesti fisiologici.

Le scoperte in corso nel mondo dei comportamenti cellulari hanno accentuato il ruolo degli stimoli meccanici, come la tensione, lo sforzo di taglio dei fluidi, la compressione e la rigidità del substrato, nel dettare le attività cellulari dinamiche come l'adesione, la migrazione e la differenziazione. Questi aspetti meccanobiologici sono di fondamentale importanza per chiarire come le cellule interagiscono e rispondono al loro ambiente fisiologico, influenzando vari processi biologici 1,2.
Nell'ultimo decennio, i saggi di aspirazione basati su micropipette si sono distinti come uno strumento versatile nello studio di diverse risposte cellulari a stimoli meccanici. Questa tecnica offre preziose informazioni sulle proprietà meccaniche intrinseche delle cellule viventi a livello di singola cellula, tra cui il modulo elastico cellulare, la rigidità e la tensione corticale. Questi saggi consentono di misurare vari parametri meccanici, come la tensione della membrana cellulare, la pressione esercitata sulla membrana cellulare e la tensione corticale (riassunta nella Tabella 1). Lo studio delle forze aspirazionali ha arricchito la nostra comprensione di come influenzano le funzioni e i processi cellulari, in particolare nell'ambito della dinamica della membrana, tra cui la frammentazione, l'allungamento e la gemmazione 3,4.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parametro meccanico</td>
			<td>Descrizione</td>
			<td>Approcci seminali</td>
		</tr><tr><td>Rigidità cellulare</td>
			<td>Misura della rigidità meccanica e dell'elasticità di una cella.</td>
			<td>Aspirazione della membrana cellulare e analisi della risposta deformativa alla pressione negativa20,21.</td>
		</tr><tr><td>Forza di adesione</td>
			<td>Valutazione della forza di adesione delle cellule alle superfici.</td>
			<td>Applicazione di aspirazione controllata per staccare le cellule aderenti da un substrato2,22.</td>
		</tr><tr><td>Tensione della membrana</td>
			<td>Valutazione della tensione o dello stress all'interno delle membrane cellulari.</td>
			<td>Misura della deformazione della membrana in risposta alla pressione applicata23,24.</td>
		</tr><tr><td>Proprietà viscoelastiche</td>
			<td>Caratterizzazione del comportamento viscoso ed elastico combinato di una cella.</td>
			<td>Analisi della risposta deformativa tempo-dipendente all'aspirazione23,25.</td>
		</tr><tr><td>Deformabilità</td>
			<td>Determinazione della facilità con cui una cellula può cambiare forma.</td>
			<td>Valutazione dell'entità della deformazione in aspirazione controllata20,24.</td>
		</tr><tr><td>Tensione superficiale</td>
			<td>Misura della tensione sulla superficie della cella.</td>
			<td>Valutazione della pressione necessaria per formare una sporgenza della membrana della micropipetta26.</td>
		</tr><tr><td>Interazione cellula-materiale</td>
			<td>Studio delle interazioni tra cellule e materiali o substrati.</td>
			<td>Aspirazione di cellule a contatto con materiali diversi e osservazione delle interazioni2,24.</td>
		</tr><tr><td>Interazione cellula-cellula</td>
			<td>Esame delle interazioni tra cellule vicine.</td>
			<td>Aspirazione di un gruppo di cellule e analisi delle loro forze intercellulari27.</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Parametri meccanici caratterizzati dal test di aspirazione con micropipetta.
La tecnica di aspirazione basata su micropipette è stata ampiamente utilizzata per studiare i globuli rossi (RBC), valutando la deformabilità e varie caratteristiche meccaniche dei RBC, che è essenziale per comprendere la loro funzione nel sistema circolatorio. I globuli rossi mostrano una notevole adattabilità, preservando la loro versatilità meccanica contro la deformazione durante la navigazione attraverso l'intricata rete capillare e le fessure interendoteliali 5,6. Durante questo viaggio, i globuli rossi devono attraversare passaggi stretti fino a 0,5-1,0 μm, sottoponendosi a una moltitudine di forze meccaniche, tra cui la tensione e la compressione 7,8,9. Hanno anche un'elevata sensibilità allo stress di taglio generato dal flusso sanguigno durante la circolazione10. Questi processi promuovono l'attivazione di meccanismi regolatori che coinvolgono l'afflusso di calcio, un evento di segnalazione cruciale con ruoli ben consolidati nelle risposte cellulari agli stimoli meccanici11,12. I complessi meccanismi che governano il meccanosensing mediato dal calcio rimangono argomenti interessanti di indagine in corso.
In questo contesto, l'fMPA rappresenta un approccio efficace per rivelare l'entità della mobilizzazione del calcio sotto forze meccaniche controllate con precisione, consentendo l'applicazione simultanea della modulazione meccanica (utilizzando il sistema di aspirazione a micropipetta) e la visualizzazione dell'intensità del calcio (utilizzando indicatori fluorescenti). Imita in particolare lo scenario fisiologico in cui i globuli rossi viaggiano attraverso il restringimento dei vasi sanguigni. Vale la pena notare che il sistema fMPA che abbiamo sviluppato può generare pressione con una risoluzione di 1 mmHg. La telecamera ad alta velocità implementata può raggiungere una risoluzione temporale di 100 ms e una risoluzione spaziale a livello submicrometrico. Queste configurazioni garantiscono l'applicazione precisa delle forze meccaniche alle cellule viventi e contemporaneamente catturano la segnalazione cellulare risultante. Inoltre, grazie alla natura ingegneristica integrativa di questa configurazione, il test di aspirazione con micropipetta può essere facilmente adattato per integrare altre apparecchiature o tecniche, consentendo un'ulteriore esplorazione delle complessità della meccanica cellulare. Questa versatilità rappresenta un ulteriore vantaggio di questo approccio.

<table><tbody><tr><td>&micro; Manager</td><td>Micro-Manager</td><td></td><td>Versione 2.0.0</td></tr><tr><td>Siringa da 1 mL&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>210320D</td><td>Collabora con il Microfil&nbsp;</td></tr><tr><td>200 &micro; L Pipetta&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>3123000055</td><td>Preparazione cella clood rossa</td></tr><tr><td>22 x 40 mm Vetrini</td><td>Knittel Glass&nbsp;</td><td>MS0014</td><td>Assemblaggio camera cellulare</td></tr><tr><td>Siringa da 50 mL&nbsp;</td><td>Terumo</td><td>220617E</td><td>Collegare alla torre dell'acqua</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Preparazione del tampone di Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl e 5,5 mM D-glucosio integrati con 1 mM di CaCl2. pH finale = 7,2</td></tr><tr><td>Centrifuga 5425</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5405000280</td><td>Preparazione delle cellule rosse</td></tr><tr><td>Clexane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1235820</td><td>Per prevenire la coagulazione del sangue raccolto. 10.000 U/mL</td></tr><tr><td>DAQami</td><td>Diligent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescenza sorgente luminosa</td><td>CoolLED</td><td>pE-300</td><td>Sistema hardware per l'aspirazione di micropipette</td></tr><tr><td>Capillare in vetro</td><td>Produzione</td><td></td><td></td> di micropipette Narishige G-1</tr><tr><td>Preparazione</td> del tampone Glucose <td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Tryode's - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl e 5,5 mM D-glucosio integrati con 1 mM di CaCl2. pH finale = 7,2</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td>Preparazione del tampone di Tryode - 12 mM di NaHCO3, 10 mM di HEPES, 0,137 M di NaCl, 2,7 mM di KCl e 5,5 mM di D-glucosio integrati con 1 mM di CaCl2. pH finale = 7,2</td></tr><tr><td>Telecamera GigE ad alta velocità</td><td>Manta</td><td>G-040B</td><td>Sistema hardware per aspirazione micropipette</td></tr><tr><td>Pinza a pressione ad alta velocità</td><td>Strumento</td><td>scientifico HSPC-2-SB</td><td>Cooperare con la pompa a pressione</td></tr><tr><td>Stadio della testa del morsetto a pressione ad alta velocità&nbsp;</td><td>Strumento scientifico</td><td>HSPC-2-SB</td><td>Collabora con la pompa a pressione</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopia invertita&nbsp;</td><td>Olimpo&nbsp;</td><td>Sistema hardware per aspirazione micropipette Olympus IX83</td><td></td></tr><tr><td>Microfil&nbsp;</td><td>Mondo Strumenti di Precisione&nbsp;</td><td>MF34G-5</td><td>34 G (67 mm di lunghezza) Analizza la bolla d'aria nella micropipetta tagliata e verifica l'apertura del puntale della pipetta&nbsp;</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette&nbsp;</td><td>Sutter instrument</td><td>P1000</td><td>Produzione di micropipette&nbsp;</td></tr><tr><td>Milli Q EQ 7000 Sistema di purificazione dell'acqua ultrapura</td><td>Merck Millipore</td><td>ZEQ7000T0C</td><td>Tampone carbonato/bicarbonato & Preparazione del tampone di Tryode</td></tr><tr><td>Microforgia per pipette</td>La <td>micropipetta</td> <td>Narishige</td><td>MF-900</td> produce</tr><tr><td>cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Preparazione del tampone di Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl e 5,5 mM D-glucosio integrati con 1 mM di CaCl2. pH finale = 7,2</td></tr><tr><td>Pompa di pressione&nbsp;</td><td>Strumento scientifico</td><td>PV-PUMP</td><td>Induce una pressione controllata durante l'esperimento</td></tr><tr><td>Prime 95B Camera</td><td>Photometrics</td><td>Prime 95B sCMOS</td><td>Flourscent imaging</td></tr><tr><td>Unità remota a rotellare&nbsp;</td><td>Sensapex&nbsp;</td><td>uM-RM3</td><td>Pannello di controllo per la regolazione della posizione della micropipetta&nbsp;</td></tr><tr><td>Contatore di cellule portatile Scepter 3.0</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC340KIT</td><td>Contatore automatico di cellule</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Preparato tampone carbonato/bicarbonato - 2,65 g di NaHCO3 con 2,1 g di Na2CO3 in 250 mL di acqua Mili Q - pH finale = 8-9.</td></tr><tr><td>Carbonato di sodio (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>Preparato tampone carbonato/bicarbonato - 2,65 g di NaHCO3 con 2,1 g di Na2CO3 in 250 mL di acqua Mili Q - pH finale = 8-9.</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Preparazione del tampone Tryode&nbsp; - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl e 5,5 mM D-glucosio integrati con 1 mM di CaCl2. pH finale = 7,2</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico monoidrato (NaH2PO4 &bull; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>Preparazione del tampone di Tryode - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl e 5,5 mM D-glucosio integrati con 1 mM di CaCl2. pH finale = 7,2</td></tr><tr><td>Unità di controllo touch screen&nbsp;</td><td>Sensapex&nbsp;</td><td>uM-TSC</td><td>Pannello di controllo per la regolazione della posizione della micropipetta&nbsp;</td></tr><tr><td>X secco Obiettivo&nbsp;</td><td>Olimpo&nbsp;</td>Sistema <td>hardware per l'aspirazione di micropipette</td> <td>Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL</td></tr></tbody></table>

test di aspirazione con micropipetta a fluorescenza per studiare il meccanorilevamento dei globuli rossi

Fluorescence Micropipette Aspiration Assay to Investigate Red Blood Cell Mechanosensing

I saggi di aspirazione con micropipette sono stati a lungo una pietra miliare per lo studio della meccanica delle cellule vive, offrendo approfondimenti sulle risposte cellulari allo stress meccanico. Questo documento descrive in dettaglio un adattamento innovativo del test di aspirazione con micropipette accoppiate a fluorescenza (fMPA). Il saggio fMPA introduce la capacità di somministrare forze meccaniche precise monitorando contemporaneamente i processi di meccanotrasduzione delle cellule vive mediati dai canali ionici. La sofisticata configurazione incorpora una micropipetta in vetro borosilicato di precisione collegata a un serbatoio d'acqua finemente regolato e a un sistema di aspirazione pneumatica, facilitando l'applicazione a pressione controllata con incrementi fino ± 1 mmHg. Un miglioramento significativo è l'integrazione dell'imaging a epifluorescenza, che consente l'osservazione e la quantificazione simultanee dei cambiamenti morfologici cellulari e dei flussi intracellulari di calcio durante l'aspirazione. Il test fMPA, attraverso la sua combinazione sinergica di imaging a epifluorescenza con aspirazione di micropipette, stabilisce un nuovo standard per lo studio del meccanorilevamento cellulare in ambienti meccanicamente difficili. Questo approccio poliedrico è adattabile a varie configurazioni sperimentali, fornendo informazioni critiche sui meccanismi di meccanorilevamento a singola cellula.

Per stabilire i saggi di aspirazione con micropipette, abbiamo prima costruito una camera cellulare personalizzata composta da due quadrati di metallo (rame/alluminio) collegati da una maniglia. Sono stati apposti due vetrini coprioggetti di terzo taglio (40 mm × 7 mm × 0,17 mm) per creare una camera riempita con 200 μL di globuli rossi sospesi nel tampone di Tyrode. Dopo aver introdotto i globuli rossi nella camera, una micropipetta in borosilicato su misura è stata fissata su un supporto e posizionata con cura all'interno della camera utilizzando un micromanipolatore. Successivamente, la micropipetta è stata avvicinata per catturare il globulo rosso bersaglio.
Per l'aspirazione delle celle, il metodo ha utilizzato una pinza a pressione pneumatica ad alta velocità per regolare con precisione la pressione di aspirazione negativa. L'imaging a fluorescenza è stato quindi condotto per studiare la mobilizzazione del calcio alle diverse pressioni di aspirazione negative applicate.
Utilizzando l'fMPA per studiare come i globuli rossi rispondono alle diverse pressioni negative di aspirazione, i nostri risultati rivelano che esiste una chiara relazione proporzionale tra la pressione negativa applicata e l'afflusso di calcio presente nei globuli rossi aspirati. Per determinare la variazione dell'intensità del calcio, l'intensità massima della singola cellula aspirata (Fmax) meno l'intensità di fondo (Fb) è stata divisa per l'intensità a riposo (F0) meno Fb. C'è stato un corrispondente aumento dell'afflusso di ioni calcio nei globuli rossi quando la pressione è stata aumentata in modo incrementale tra -10 mmHg (Figura 3A) e -40 mmHg (Figura 3D). Ciò suggerisce che i globuli rossi possiedono la capacità di percepire i cambiamenti nella loro meccanica e di rispondere con rapide attività dei canali calcio-specifici14,15.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66265/66265fig03.jpg"> Figura 3: Imaging a fluorescenza con una rappresentazione grafica delle variazioni di intensità normalizzate nel tempo. Orizzontalmente di traverso sono raffigurate istantanee a fluorescenza dei globuli rossi a riposo (a sinistra) e dei globuli rossi umani aspirati dalla micropipetta (al centro). Tracce rappresentative dei globuli rossi aspirati a pressioni di aspirazione negative multiple (Δp) possono essere viste sulla destra. La pressione di aspirazione negativa viene aumentata in modo incrementale, a partire da (A) Δp = -10 mmHg, (B) Δp = -20 mmHg, (C) Δp = -30 mmHg e (D) Δp = -40 mmHg. Quando la lingua dei globuli rossi è allungata durante l'aspirazione, si può osservare una significativa mobilizzazione del calcio, come mostrato dall'aumento del cambiamento di piega di Cal-520 AM. F/F0 è stato utilizzato per studiare la mobilizzazione del calcio all'interno dei globuli rossi aspirati. Dalle curve di cui sopra, la tendenza osservata ha dimostrato che il segnale Cal-520 AM aumenta proporzionalmente all'aumento della pressione di aspirazione negativa applicata. Barra della scala = 5 μm. Abbreviazione: RBCs = globuli rossi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella supplementare S1: Punti di controllo per i passaggi critici nei protocolli di preparazione fMPA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265_Supplementary%20File%20-%20Table%20S1%20-%20JoVE.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>
File supplementare 1: un processo guidato per regolare ed eseguire la segmentazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66265/66265_Supp%20File%201.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

L'esplorazione del comportamento cellulare sotto stress meccanico è fondamentale per i progressi della meccanica cellulare e della meccanobiologia. Introduciamo la tecnica di aspirazione a fluorescenza con micropipette (fMPA), un nuovo metodo che combina la stimolazione meccanica controllata con l'analisi completa della segnalazione intracellulare nelle singole cellule. Questa tecnica indaga nuovi studi approfonditi sulla meccanobiologia delle cellule vive.

Test di aspirazione con micropipetta a fluorescenza per studiare il meccanorilevamento dei globuli rossi

Micropipette aspiration assays have long been a cornerstone for the investigation of live-cell mechanics, offering insights into cellular responses to ...

Lo scopo della nostra ricerca è diretto verso la meccanobiologia dello stile di vita, in particolare il comportamento delle cellule in cui viene applicato lo stress meccanico. Stiamo studiando la segnalazione intracellulare nelle singole cellule. Il sistema FMPA proposto utilizza l'imaging a fluorescenza combinato con stimoli meccanici.Cioè, la pressione di aspirazione. Attualmente ci sono ulteriori progressi che hanno tentato di combinare più di due tecniche con la configurazione della microaspirazione, come la microfluidica o il software di analisi delle immagini. Le attuali sfide sperimentali risiedono nel fatto che la configurazione è piuttosto laboriosa e dipende dall'operatore.Poiché il sistema viene azionato manualmente, ci sono incongruenze che sorgono in passaggi specifici. Ad esempio, il preriscaldamento del filamento. I risultati della ricerca hanno dimostrato che c'è stato un corrispondente aumento dell'afflusso di ioni calcio nei globuli rossi quando la pressione è stata aumentata in modo incrementale tra il mercurio negativo di 10 millimetri e il mercurio negativo di 40 millimetri.Ciò suggerisce che i globuli rossi hanno la capacità di percepire i cambiamenti nel loro ambiente meccanico e di rispondere con rapide attività dei canali correlati al calcio. Questo studio pone particolare enfasi sull'applicazione della FMPA come strumento cruciale per svelare le risposte meccanosensibili sfumate mostrate dai globuli rossi sotto stimoli variabili.

fluorescence-micropipette-aspiration-assay-to-investigate-red-blood

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Un test per la misurazione della frequenza adesione recettore-ligando cinetiche di interazione quando entrambe le molecole sono ancorate sulla superficie delle cellule interagiscono è descritto. Questo test meccanico-based è esemplificato con una micropipetta pressurizzato globulo rosso umano come sensore di adesione e integrina αLβ2 e molecola di adesione intercellulare-1 come interagire recettori e ligandi.

Adesione saggio di frequenza per In Situ Analisi cinetica delle interazioni molecolari incrociati giunzionale alla cellula-cellula di interfaccia

Qui si descrive un metodo rapido e semplice per misurare la rigidità delle cellule. Il principio generale di questo approccio è di misurare la deformazione della membrana in risposta a ben definito pressione negativa applicata mediante una micropipetta alla superficie cellulare. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare le proprietà biomeccaniche del substrato-attached cellule.

Aspirazione Micropipetta di celle substrato-attached per Stima rigidità cellulare

In questo video, le sonde di forza a biomembrana (BFP) vengono utilizzate per misurare le forze tra recettori e ligandi. Questa tecnica è in grado di rilevare le interazioni monitorando la pressione necessaria per rompere i legami tra il pMHC coniugato sulle perle della sonda e i TCR sulle cellule bersaglio.

Sonda di forza biomembrana per quantificare le interazioni recettore-ligando

Il protocollo descritto dettagli una procedura sperimentale per quantificare globuli rossi (RBC) aggregati con un gradiente di velocità controllata e costante, basato su tecniche di elaborazione delle immagini. L'obiettivo di questo protocollo è di mettere in relazione le dimensioni aggregate RBC al corrispondente gradiente di velocità in un ambiente controllato microfluidica.

Ambiente controllato Microfluidic per Dynamic Indagine Globulo rosso Aggregazione

Descriviamo una tecnica per misurare contemporaneamente la cinetica di legame del singolo recettore-ligando regolata dalla forza e l'imaging in tempo reale della segnalazione del calcio in un singolo linfocita T.

Fluorescenza Biomembrane Forza Probe: quantificazione simultanea di Cinetica recettore-ligando e Binding-indotta intracellulare segnalazione su una singola cella

Qui, presentiamo un protocollo per l'uso simultaneo di Förster risonanza energia basati sul trasferimento di tensione sensori per misurare recupero carico e fluorescenza della proteina dopo photobleaching per misurare la dinamica della proteina che permette la misurazione di sensibili alla forza dynamics della proteina nelle cellule viventi.

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Le forze meccaniche sono importanti per controllare la migrazione cellulare. Questo protocollo dimostra l'uso di idrogel elastici che possono essere deformati utilizzando una micropipetta di vetro e un micromanipolatore per stimolare le cellule con un gradiente di rigidità locale per suscitare cambiamenti nella struttura cellulare e nella migrazione.

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Presentato qui è un metodo per fenotipizzare meccanicamente singole cellule utilizzando una piattaforma microfluidica basata sull'elettronica chiamata mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Questa piattaforma mantiene un throughput moderato di 1-10 cellule / s misurando sia le proprietà biofisiche elastiche che viscose delle cellule.

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Scopri la tecnica di aspirazione con micropipetta a fluorescenza per studiare il meccanorilevamento nei globuli rossi. Questo metodo rivela come l'aumento della pressione influenzi l'influsso di ioni calcio nelle cellule.

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