Name: Isolamento delle cellule endoteliali pancreatiche di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Scopri un protocollo di dissociazione delicata e ordinamento magnetico per isolare cellule endoteliali pancreatiche di topo con elevata vitalità. Questo metodo consente di analizzare marcatori cellulari e profili trascrittomici per studiare la vascolarizzazione pancreatica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Semplificazione dell'estrazione di cellule endoteliali panteliali di topo per studi sulla malattia

<table><tbody><tr><td>1,5 mL eppendorf</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>piatto da 10 cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>aghi 25G</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix</td><td>Vazyme</td><td>Q712-03-AA</td><td></td></tr><tr><td>5 mL eppendorf</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>14282300</tr><tr><td>piastra a 6 pozzetti</td><td>Greiner Bio-One</td><td>07-000-208</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; colino</td><td>Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31-biotina</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>REA784</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino albumina trattato con shock termico</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagene Tipo 1, da pelle di vitello</td><td>Sigma Aldrich& nbsp;</td><td>C9791</td><td>Reagente di attacco nel protocollo</td></tr><tr><td>Collagenasi Tipo 1&nbsp;</td><td>Worthington Bio</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Countess Contatore automatico di celle</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td>bisturi di sicurezza monouso per immunofluorescenza</td></tr><tr><td></td><td>Myco Instrumentation</td><td>6008TR-10</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>260913&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (Ca2+,Mg2+)Thermo</td> <td>Fisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14080055</tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Fisher</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td></td><td></td><td>Mantenuto a 37 gradi C 5% CO2</td></tr><tr><td>LS Colonne</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma</td><td>M2520-1L</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand con il separatore QuadroMACS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Medio 199</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>M2520-10X</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere anti-biotina</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica</td><td></td><td>Per valutare la morfologia cellulare</td></tr><tr><td>Grado molecolare Acqua</td><td>Corning</td><td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R Agitatore orbitale&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab56299</td><td>immunofluorescenza</td></tr><tr><td>PECAM1 (CD31) Anticorpo</td><td>R& D Systems</td><td>AF3628</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (10X) (no Ca2+, no Mg2+)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-507-XB</td><td></td></tr><tr><td>Primer 36B4 Forward mouse</td><td>IDT</td><td></td><td>AGATTCGGGATATGCTGTTGGC</td></tr><tr><td>Primer 36B4 Revese mouse&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC</td></tr><tr><td>Primer Kdr Mouse in avanti&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCAGAATCCTCTTCCATGC</td></tr><tr><td>Primer Kdr Reverse mouse</td><td>IDT</td><td></td><td>AAACCTCCTGCAAGCAAATG</td></tr><tr><td>Primer Nkx6.1 Reverse mouse&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>CACGGCGGACTCTGCATCACTC</td></tr><tr><td>Primer Nxk6.1 Mouse in avanti</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCTACTTTAGCCCCAGCG</td></tr><tr><td>Primer PECAM1 Mouse in avanti</td><td>IDT</td><td></td><td>ACGCTGGTGCTCTATGCAAG</td></tr><tr><td>Primer PECAM1 Reverse mouse</td><td>IDT</td><td></td><td>TCAGTTGCTGCCCATTCATCA</td></tr><tr><td>RNase ZAP</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di RNasi</td><td>Takara</td><td>RR036B</td><td></td></tr><tr><td>Pinza sterile lunga 12"</td><td>F.S.T</td><td>91100-16</td><td></td></tr><tr><td>Pinza fine sterile</td><td>F.S.T</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fine sterili</td><td>F.S.T</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale 2cm</td><td>Reagente TRIzol Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>inibitore della tripsina&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10109886001</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VE-Caderrina Anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento delle cellule endoteliali pancreatiche di topo

Isolation of Mouse Pancreatic Endothelial Cells

Seguendo questo protocollo, è possibile ottenere circa 2 x 106 cellule vive quando si raggruppano 3 pancreas di topo e 750.000 cellule da un singolo pancreas di topo. Per convalidare l'arricchimento di EC, abbiamo eseguito le seguenti analisi: 1) PCR quantitativa: rispetto ai campioni flow-through (FT) (cioè le frazioni legate agli anticorpi non CD31), le frazioni EC avevano livelli significativamente più elevati di Pecam1 (codificante CD31) e Kdr (codificante VEGFR2), due geni marcatori EC33 e livelli più bassi di NK6 omeobox 1 (Nkx6.1), un fattore di trascrizione nelle cellule endocrine pancreatiche (Figura 4A); 2) Western blotting: campioni arricchiti di EC da tre preparazioni (pEC-1-3) hanno mostrato forti segnali di CD31 alla dimensione prevista (~130 kDa). In confronto, i campioni di input e FT hanno mostrato un segnale CD31 minimo. Come controllo positivo, anche i lisati delle cellule MS1, una linea cellulare pEC, hanno mostrato un forte segnale CD31 (Figura 4B); 3) colorazione con blu di tripano: abbiamo riscontrato che la vitalità delle cellule isolate era di circa il 50% (Figura 4C); 4) citometria a flusso seguendo un protocollo pubblicato15 : attraverso il gating sulla popolazione di cellule vive (Figura 4D), abbiamo riscontrato che le cellule CD31+ erano all'88% e le cellule TdTomato+ al 76%. Da notare che la maggior parte delle cellule isolate co-esprime CD31 e TdTomato (Figura 4E). Come controlli negativi, le cellule MS1 non colorate e MS1 incubate con IgG non hanno mostrato cellule vive come marcato da CD31. Come controllo positivo, cioè le cellule MS1 colorate per CD31 hanno mostrato quasi il 100% di cellule CD31+ vive (Figura 4F). Abbiamo anche coltivato le cellule isolate, eseguito la colorazione in immunofluorescenza di PECAM1 seguendo un protocollo36 pubblicato e analizzato TdTomato, che ha mostrato segnali robusti di entrambi i marcatori nelle cellule isolate, suggerendo la presenza di EC (Figura 4G).
<img alt="Diagramma del pancreas che illustra le EC intra-insulari per lo studio della struttura vascolare e l'analisi dell'interazione cellulare." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Illustrazione della vascolarizzazione del pancreas e delle isole pancreatiche. Una rappresentazione pittorica delle cellule endoteliali pancreatiche (EC) e delle EC intra-insulari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Schema di preparazione del pancreas unicellulare; centrifugazione, marcatura della biotina CD31, analisi a flusso continuo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Panoramica del flusso di lavoro. 1) Dissezione del pancreas, 2) digestione meccanica, 3) incubazione enzimatica, 4) centrifugazione, 5a) rimozione del surnatante e 5b) digestione secondaria della collagenasi dei pellet cellulari con triturazione per il filtraggio in 6), 7) e 8) ricostituzione del pellet e legame degli anticorpi, 9) incubazione delle microsfere, 10) arricchimento della colonna MACS, 11) conteggio delle cellule per la vitalità e 12) analisi a valle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Dissezione tissutale che mostra il processo di raccolta, isolamento e rifilatura del pancreas nella ricerca biologica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Fasi di lavorazione dei tessuti. Immagini di (A) la cavità addominale, (B) il pancreas di topo isolato e (C) il pancreas di topo tagliato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Risultati dell'espressione genica, dell'analisi del CD31, DAPI, della selezione cellulare, della fluorescenza e della citometria a flusso." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Validazione di frazioni di EC isolate da pancreas di topo. (A) qPCR di campioni di FT e frazione di EC arricchita con CD31 per l'arricchimento. Pecam1 (CD31), Kdr (VEGFR2) e Nkx6.1 (fattore di trascrizione pancreatico specifico per β cellule)33. * indica p &lt;0,05 rispetto a FT in base ai test t . n = 3-4 campioni aggregati, costituiti da 3 topi ciascuno. (B) Western blotting di CD31. pEC-1-3 indica EC arricchite da 3 campioni di topi aggregati separati. Su ciascuna corsia sono stati caricati lisati cellulari di 30 mg, seguiti dalla colorazione Ponceau S. (C) Conteggio cellulare e colorazione con blu di tripano di pEC arricchite per il saggio di vitalità. (D) Strategia di gating della citometria a flusso per pEC di topo colorate con anticorpi 4', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e CD31. (E) Istogrammi di citometria a flusso di MS1 non colorato (in alto a sinistra), MS1 colorato con anticorpo secondario AlexaFluor-488 (controllo IgG; in alto a destra), MS1 colorato con CD31 (in basso a sinistra) e le pEC isolate di topo colorate con CD31 (in basso a destra). (F) Percentuale di cellule vive quantificate mediante citometria a flusso. (G) Immunofluorescenza dell'espressione di CD31 (verde) con controcolorante DAPI (blu) e reporter fluorescente endogeno TdTomato (rosso). Barra della scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Microscopia a immunofluorescenza CD31/CD144/DAPI, analisi dell'espressione genica UMAP di Cdh5, Pecam1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66690/66690fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: Specificità di CD31 e CD144 nel pancreas di topo. (A) Immunofluorescenza del pancreas di topo con CD31 (Magenta) e CD144 (ciano), con controcolorazione DAPI. Immagine acquisita utilizzando un obiettivo 10x con un microscopio invertito fluorescente a campo largo. Barra di scala = 100 μm. Le linee tratteggiate delimitano l'area dell'isolotto. (B) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) che mostra l'espressione di Cdh5 e Pecam1 nelle EC delle isole da topi C57BL6 rilevata da scRNA-seq (GSE128565)37. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66690/66690fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Enzima</td>
			<td>Usare</td>
			<td>Temperatura e tempo</td>
			<td>Riferimento</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenasi I</td>
			<td>Dissociazione di singole cellule, arricchimento EC dell'intero pancreas</td>
			<td>37 °C, 20 min</td>
			<td>Questo protocollo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenasi IV</td>
			<td>Isolamento delle isole e dissociazione non enzimatica</td>
			<td>37 °C, 20 min</td>
			<td>46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenasi + Tripsina</td>
			<td>Esame delle cellule duttali nel pancreas di topo</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>47</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenasi B</td>
			<td>Sospensione a singola cellula del pancreas</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenasi NBI</td>
			<td>Isolamento delle isole</td>
			<td>37 °C, 30 min</td>
			<td>49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenasi P</td>
			<td>Sospensione praticabile Acinar</td>
			<td>37 °C, 15 min</td>
			<td>45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenasi XI</td>
			<td>Isolamento delle isole</td>
			<td>37 °C, 15 min</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Sospensione a cella singola</td>
			<td>37 °C, 45 min</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberate</td>
			<td>Sospensione a cella singola</td>
			<td>37 °C, 10 min</td>
			<td>25, 48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripsina</td>
			<td>Dissociazione di singole cellule, pancreas intero</td>
			<td>4 °C, O/N</td>
			<td>28</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Riepilogo dei vari protocolli utilizzati per elaborare campioni di pancreas di topo.

Isolamento delle cellule endoteliali pancreatiche di topo

The pancreas is a vital organ for maintaining metabolic balance within the body, in part due to its production of metabolic hormones such as insulin and ...

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Biology

Biologia

Le isole pancreatiche, chiamate anche isole di Langerhans, sono un gruppo di cellule endocrine che producono ormoni per la regolazione del glucosio e altre importanti funzioni biologiche. Questo protocollo spiega un metodo per isolare le isole pancreatiche mediante prima perfusione di collagenasi tramite l'ampolla di Vater per digerire il tessuto pancreatico esocrino e una centrifugazione semplificata in gradiente di densità per purificare le isole dai topi.

Isolamento delle isole pancreatiche attraverso la perfusione di collagenasi: un metodo enzimatico per isolare le cellule delle isole pancreatiche

In questa pubblicazione, si descrive una procedura rapida e conveniente per l'isolamento e la coltura primaria cellule pancreatiche acinose del pancreas murino. Questo metodo costituisce un valido approccio per studiare la fisiologia delle cellule esocrine del pancreas freschi primarie normali / non trasformata.

Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

Presentiamo qui un protocollo per l'isolamento delle isole dal modello murino di diabete di tipo 2, Leprdb e i dettagli di un test su cellule vive per la misurazione della secrezione di insulina da isole intatte che utilizza la microscopia a 2 fotoni.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Questo protocollo è preparato per condividere il nostro metodo di isolamento delle cellule endoteliali coronariche di topo a scopo di imaging o per condurre esperimenti di biologia molecolare.

Isolamento di cellule di topo coronarica endoteliali

Descriviamo qui un protocollo per isolare isolotti intatti da topi neonati. Pancreas sono stati parzialmente digerito con collagenasi, seguita da lavaggio e raccolta manuale. 20 - 80 clusters insule possono essere ottenuti per pancreas da topi appena nati, che sono adatti per diversi studi insulari.

Efficace isolamento di isole funzionali da neonatali mouse Pancreas

Questo protocollo di isolamento dell'isolotto ha descritto una nuova via di iniezione di collagenasi per digerire il tessuto esocrino e una procedura di gradiente semplificata per purificare le isole dai topi. Si tratta di digestione ezimatica, separazione/purificazione del gradiente e raccolta a mano dell'isolotto. Il successo dell'isolamento può produrre 250-350 isolotti di alta qualità e completamente funzionali per mouse.

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Qui presentiamo un protocollo per isolare le cellule delle isole pancreatiche del mouse per lo screening di induzioni ROS dai xenobiotici al fine di identificare i potenziali prodotti chimici xenobiotici diabetogeni.

Uno Screening basati su cellule dell'isolotto pancreatico murino per prodotti chimici ambientali diabetogeni

Qui presentiamo un protocollo per l'imaging e la quantificazione della dinamica del calcio in popolazioni cellulari eterogenee, come le cellule delle isolotiche pancreatiche. I reporter fluorescenti vengono consegnati nello strato periferico delle cellule all'interno dell'isolotto, che viene poi immobilizzato e immagine, e viene eseguita l'analisi per cellula della dinamica dell'intensità della fluorescenza.

Imaging calcio Dynamics in sottopopolazioni di cellule di islet pancreatica del topo

Qui delineiamo e dimostriamo un protocollo per l'isolamento primario delle cellule endoteliali sinusoidali epatiche del topo (LSEC). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi epatica, sulla purificazione delle cellule non parenchimali mediante centrifugazione a bassa velocità e sulla selezione magnetica delle perline CD146. Abbiamo anche fenotipo e caratterizzato questi LSECs isolati utilizzando la citometria a flusso e la microscopia elettronica a scansione.

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

In questo articolo, le cellule endoteliali polmonari primarie sono state isolate e coltivate da topi neonatali.

Isolamento delle cellule endoteliali polmonari primarie di topo

Questo studio ha sviluppato un metodo semplificato per estrarre in modo efficiente isolotti primari funzionali e cellule acinar dal pancreas del topo, offrendo uno strumento prezioso per studiare la comunicazione intercellulare nella patogenesi del diabete indotto da pancreatite acuta.

Un metodo semplice e rapido per l'isolamento simultaneo degli isolotti primari e delle cellule acinari pancreatiche primarie da topi

Scopri un protocollo di dissociazione delicata e ordinamento magnetico per isolare cellule endoteliali pancreatiche di topo con elevata vitalità. Questo metodo consente di analizzare marcatori cellulari e profili trascrittomici per studiare la vascolarizzazione pancreatica.

Isolamento delle cellule endoteliali pancreatiche di topo

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