Name: Preparación de balas de cañón de genes y transfección biolística de neuronas en cultivo Cortar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: Aprende a preparar balas de genes recubiertas de ADN y realizar transfección biolística en neuronas de rebanadas de hipocampo de rata. Este método permite visualizar neuronas individuales con un fondo limpio para estudios de morfología.

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Nos gustaría agradecer a Mark Lucanic y Cheng Hwai-Jong en busca de ayuda con la adquisición de las imágenes de bajo aumento de la totalidad de rodajas de hipocampo presenta en este video. También nos gustaría agradecer a Sarah Parrish para ayudar con el texto que acompaña al video.

PROTOCOLO para la transfección biolística Hacer balas Las balas son buenas para un máximo de 6 meses, pero puede comenzar a disminuir en la eficiencia de la transfección después de 2-3 meses. Las balas deben ser almacenadas a 4 ° C en presencia de gránulos de desecante. Siempre que los viales de centelleo, en el que se almacenan las balas, la temperatura ambiente antes de abrir el vial. Antes de empezar se han preparado: <ul><li> Espermidina (0,05 M) </li><li> CaCl2 (1M) </li><li> EtOH (100%-de alto grado sin abrir la botella) </li><li> Autoclave H 2 0 </li><li> De ADN que se transfectaron </li><li> Polivinilpirrolidona (PVP-20 mg / ml) </li><li> 2 X 15 mL cónico (2/bullet juego) </li><li> Tubos (cortado en 1 X ~ 30 pulgadas / conjunto de bala) </li><li> Centelleo viales (conjunto 1/bullet) </li><li> Pellets de desecación </li><li> 10 ml jeringa w / tubo en el extremo </li></ul> Prepare la tubería: <ol><li> Seca ~ 30 pulgadas de tubo (cerca de 2 pulgadas se extiende más allá del bien O-ring) en la estación de tubo w / N 2 gas (0,4 de presión) por un mínimo de 20 min. </li></ol> Precipitar el ADN de cuentas de oro: <ol><li> Prepare de ADN que se transfectadas en un volumen de 50 μmL total en tubo de microcentrífuga (máximo 50 mg de ADN total) </li><li> Pesar de 6.8 mg de oro y la transferencia a un tubo de microcentrífuga </li><li> Añadir 100 ml de 0,05 M espermidina de oro y ultrasonidos durante 20 segundos </li><li> Agregue el l 50 de ADN para el oro / espermidina </li><li> Vortex (en torno al establecimiento de 5) w / tapa abierta </li><li> Añadir gota a gota 100 l de 1 M de CaCl2 </li><li> Tratar brevemente con ultrasonidos (&lt;5 segundos) </li><li> Dejar decantar durante 10 minutos a temperatura ambiente </li><li> Tratar brevemente con ultrasonidos </li></ol> Prepare una solución de PVP en ultrasonidos: <ol><li> Haz una solución diluida de PVP en cónico de 15 ml, diluir 3.5mL PVP para cada conjunto de puntos (añadir 7,5 l de 20mg/ml acciones PVP a 3,5 ml EtOH al 100%) </li></ol> Enjuague cuentas de oro con EtOH: <ol><li> Decantar cuentas de oro a toda velocidad durante 10 segundos en microcentrífuga </li><li> Desechar el sobrenadante, pero mantener una pequeña cantidad de líquido en la parte superior de perlas de oro </li><li> Lave 3 veces con 1 ml de EtOH, tratar brevemente con ultrasonidos cada vez, si es necesario </li></ol> Resuspender oro / ADN en la solución de PVP: <ol><li> Resuspender el precipitado de oro en 200 l de los 3,5 ml diluida PVP / EtOH solución </li><li> Vortex la bolita de oro para volver a suspender (breve ultrasonidos, si es necesario) </li><li> Transferir el l 200 de oro / solución de PVP de un nuevo cono de 15 ml </li><li> Continúe de esta manera, la adición de 200 L de PVP en un momento hasta que todo el oro ha sido transferido a la forma cónica de 15 ml, y el volumen final es de 3,2 mL </li></ol> Revestimiento de la tubería: <ol><li> Apague el N 2 en la estación de la tubería y remover el tubo seco </li><li> Conecte el tubo de secado a la jeringa de 10 ml </li><li> Agitar enérgicamente el cónico de 15 ml llena de oro / PVP </li><li> Coloque el extremo del tubo de oro / solución de PVP y aspirar lentamente con cuidado para evitar las burbujas </li><li> Deja ~ 2 pulgadas en seco de los dos extremos de la tubería </li><li> Con el tubo todavía unido a la jeringa y se llena con la solución de oro / PVP, se coloca cuidadosamente el tubo en la estación </li><li> Marcan el final del tubo donde se encuentra la solución </li><li> Deje que el oro reposar durante 5 minutos con la jeringa acoplada </li><li> Succión de la solución muy lentamente tirando de la jeringa para que el oro se establecieron se quede atrás (que no está seguro de hacer una copia de lavado) </li><li> Desconecte la jeringa </li><li> Girar 90 ° y deje reposar 2 segundos </li><li> Girar 180 ° y deje reposar de 2 segundos </li><li> Rotar el tubo durante 5 segundos </li><li> Encienda el N 2, de modo que la válvula se lee entre 0,4 a 0,5 y girar el tubo recubierto de oro durante el secado de 5 min. </li></ol> Corte de la tubería: <ol><li> Retire el tubo de la tubería de la estación de preparación y corte los extremos en las marcas. </li><li> Ponga un vial de centelleo etiquetados bajo el helicóptero tubo para coger los cartuchos de corte </li><li> Coloque los tubos en el helicóptero tubería y cortar el tubo con la navaja de limpieza </li><li> Coloque una pellets desecación en vial de centelleo </li><li> Almacene los cartuchos a 4 ° C </li></ol> Disparos cortes de tejido Al disparar rebanadas cultivadas, es importante emplear una técnica relativamente estéril, con el fin de evitar la contaminación. Recuerde, que al disparar dos construcciones diferentes, ambos conjuntos de balas se pueden cargar en el soporte del cartucho mismo, pero el barril-liner y la pantalla debe ser cambiado entre las construcciones. Antes de empezar se han preparado: <ul><li> Balas de ADN (que vial de centelleo de la temperatura ambiente antes de la apertura) </li><li> Cortes de tejido </li><li> Helios pistola de genes </li><li> Tanque de helio con una manguera de pistola de genes unidos &lt;/ Li&gt; <li> Cartucho de titular </li><li> Revestimiento de barril de plástico con junta tórica en su lugar </li><li> Difusor (modificado) </li><li> Difusor de pantalla </li><li> Fórceps </li></ul> Preparar la pistola de genes: <ol><li> Utilizando unas pinzas colocar los cartuchos de oro recubiertas de plástico en el soporte del cartucho. </li><li> Coloque el soporte del cartucho en la pistola de genes, en primer lugar hacer retroceder bloqueo </li><li> Asegure el soporte del cartucho con el bloqueo </li><li> Obtener un revestimiento de cañón con una junta tórica y el difusor en su lugar </li><li> Atornille el barril-liner en la pistola de genes </li></ol> Disparos rodajas cultivadas con la pistola de genes: <ol><li> Póngase tapones para los oídos </li><li> Conecte la pistola de genes en la manguera conectada tanque de gas helio </li><li> A su vez la presión en el tanque de 180 PSI </li><li> Disparar a un blanco en el aire con el fin de eliminar el polvo y los escombros de la pantalla difusora. Para disparar el arma, primero presione el botón de bloqueo de seguridad hasta que suene el arma, luego apretar el gatillo. </li><li> Después de disparar el espacio en blanco, quitar los trozos de la incubadora </li><li> Avance arma para construir primero </li><li> Dispara con el difusor de 0,5 a 1 pulgada de la parte </li><li> Avanzar en el cartucho entre los pozos. </li><li> Después de disparar el último pozo, colocar las rodajas de nuevo en la incubadora </li><li> Apague la presión del gas y la liberación antes de desmontar la pistola de la manguera de helio </li><li> Desenroscar el barril de línea, y retire el cartucho y las conchas utilizadas </li></ol> Limpieza de cartucheras y fundas barril: <ol><li> Cartuchos de lugar, revestimientos barril, y las pantallas de difusor en un vaso con agua y jabón </li><li> Lugar vaso en baño de ultrasonido y sonicar durante 20 minutos </li><li> Lave con abundante agua hasta que todos los residuos de jabón se eliminan </li><li> Remoje en un 70% EtOH durante una hora </li><li> Colocar en una toalla de papel seca durante la noche para en seco </li><li> Limpiar los cartuchos, los revestimientos barril, y las pantallas se puede reutilizar en posteriores transfecciones biolística </li></ol> Consejos de resolución de problemas para la transfección biolística Transfección biolística a veces puede resultar en condiciones óptimas de transfección. Esto puede llevar a muy pocos o muy transfectadas muchas células, demasiado alta o demasiado baja los niveles de expresión, o pueden causar cortes de tejido para ser generalmente insalubres. A menudo, las rebanadas consecuencia malsana de la explosión de presión. Estos son algunos consejos para obtener de manera óptima transfectadas cortes de tejido. Si los segmentos parecen ser poco saludables (o si demasiadas células son transfectadas / corte), trate de: <ul><li> aumentar la distancia de tiro </li><li> disminuir la presión en el tanque de gas </li><li> disminuir la cantidad de oro </li><li> cortando el centro del difusor Bio-Rad y la sustitución del centro, con una pantalla difusora. </li></ul> Si las células son muy pocos los transfectadas, trate de: <ul><li> disminuyendo la distancia de disparo </li><li> aumento de la presión en el tanque de gas </li><li> el aumento de la cantidad de oro </li><li> aumentar el número de cortes de tejido / bien </li><li> asegúrese de que la junta tórica en el barril-liner está intacto. </li></ul> Si usted obtiene con las dos rebanadas de demasiadas células transfectadas y muy pocos en el rodaje mismo asegúrese de que: <ul><li> que usted está sosteniendo el arma sobre simétricamente bien </li><li> que el oro es uniformemente recubrir el interior de la tubería. (Si usted está recibiendo una línea de oro, extraer el sobrenadante de la tubería a un ritmo más rápido una vez que el oro se ha asentado y gire el oro ya antes de encender el nitrógeno. Si, por el contrario, vas a encontrar vetas de oro , esto es probablemente debido a la exposición a un exceso de humedad durante la fabricación de bala: asegúrese de que está utilizando una botella sin abrir de EtOH, que el tubo esté completamente seco antes de pintar, y que las tapas de nivelación y preparación de las balas en el momento oportuno). </li></ul> Si la eficiencia de transfección parece óptimo (# células transfectadas / corte), pero el nivel de expresión parece demasiado alto o demasiado bajo: <ul><li> ajustar el ADN relación al oro. (Por ejemplo, si es demasiado baja mantener la cantidad de oro, pero aumentar la cantidad de ADN.) </li><li> ajustar la cantidad de tiempo entre la toma y recolección de datos </li></ul> En el caso de la transfección doble, si usted está recibiendo muy poca expresión de uno de sus construcciones, ajustar la relación de las dos construcciones de la manera adecuada y asegúrese de que ambas construcciones se encuentran bajo el mismo promotor, a fin de asegurarse de que una promotor no fuera de competencia a la otra.

<ol><li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li>
<li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li>
<li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
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Transfección biolística es un medio físico de la transfección de células a través de bombardeo de los tejidos vivos de alta velocidad de las partículas de oro recubiertas de ADN. En la transferencia de genes mediada por partículas, en general, las células transfectadas se producen cuando la bala se detiene en el núcleo. Mientras que muchos métodos de transfección existen diferentes, tales como la microinyección, lipofección, fosfato de calcio transfección, electroporación y transfección viral, la transfección biolística puede ofrecer una mano de obra menos intensiva y alternativa eficiente para la transfección de células que no son fácilmente transfectadas con estos otros métodos. De hecho, fue desarrollado como una técnica de transferencia de genes en las plantas ya que la presencia de la pared celular hecho difícil transfección mediante métodos preexistentes 1. Del mismo modo, biolística ha ganado popularidad en el campo de la neurobiología ya que las neuronas post-mitóticas son muy difíciles de transfectar 2,3. En particular, es ampliamente reconocido como la técnica de principio a ser utilizados en experimentos destinados a evaluar la morfología fina de neuronas individuales en rodajas de cerebro intacto. Los métodos descritos aquí dar una explicación completa y detallada de cómo llevar a cabo la transfección biolística de rodajas de cerebro de cultivo con una mano gen-gun (el sistema Helios Gene Gun Bio-Rad). Transfección biolística se ha convertido en el método preferido para la transfección de las neuronas en la cultura de corte, ya que permite la transfección de un escaso número de células a lo largo de la porción del cerebro. De esta manera, las neuronas individuales pueden examinarse de manera aislada. Dado que esta técnica es especialmente adecuado para la transfección de las neuronas en cortes de cerebro, a menudo se utiliza en combinación con 2-fotón microscopio, ya que dos fotones de excitación permite la visualización de las células de la etiqueta fluorescente en lo profundo de los tejidos dispersión de la luz 4. De hecho las imágenes de gran aumento de las neuronas piramidales única presentada a través de este vídeo se capturaron con una hecha a la medida de 2 fotones microscopio de barrido láser. En conclusión transfección biolística es un medio eficaz para la transfección de células individuales en el contexto de una alta densidad de las células circundantes, y como tal ha demostrado ser extremadamente útil para la fluorescencia de etiquetado neuronas individuales en la cultura de corte neuronal.

Aunque hemos hecho una lista de todos los productos por separado, es más económico comprar &quot;Helios Gene-Gun System&quot;, que incluye todos los productos de Bio-Rad mencionados anteriormente (cat # 165 hasta 2.431).

preparación de balas de cañón de genes y transfección biolística de neuronas en cultivo cortar

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Transfección biolística es un medio físico de la transfección de células de los tejidos mediante el bombardeo con partículas de alta velocidad de ADN recubierto. Ofrecemos un protocolo detallado para la transfección biolística de rodajas de hipocampo de rata, desde la preparación inicial de las balas recubiertas de ADN con el tiroteo final de las culturas rebanada organotípicos con una pistola de genes. Transfección de genes arma es un medio eficiente y fácil de transfectar neuronas y es especialmente útil para el etiquetado fluorescente de un pequeño subconjunto de las células en el segmento del tejido. En este video, lo primero que describen los pasos necesarios para capa de partículas de oro con el ADN. A continuación se muestra cómo la línea interior de un tubo de plástico con las balas de oro / de ADN, y la forma de cortar este tubo para obtener los cartuchos de plástico para la carga en la pistola de genes. Finalmente, se realiza la transfección biolística de las culturas de ratas rebanada hipocampo, lo que demuestra el manejo de la Bio-Rad Helios pistola de genes, y ofrecer asesoramiento resolución de problemas para obtener cortes de tejido sano y transfectadas de manera óptima.

Se describe un método para la preparación de las balas recubiertas de oro de ADN y demostrar el uso de balas como para transfectar biolistically neuronas en cultivos de rodajas de hipocampo.

Preparación de balas de cañón de genes y transfección biolística de neuronas en cultivo Cortar

La transfección biolística es un medio físico de transfección celular mediante el bombardeo de tejido con partículas recubiertas de ADN a alta velocidad. Proporcionamos un ...

La transfección mediante partículas bióticas o con cañón de genes es un método físico de transfección celular que consiste en bombardear tejidos con partículas recubiertas de ADN a alta velocidad. Esta técnica es un medio eficiente y sencillo para transfectar neuronas, y resulta especialmente útil para transfectar solo un pequeño número de células en un corte de tejido. Por ejemplo, en microscopía fluorescente, se utiliza en estudios destinados a examinar la morfología neuronal en un corte intacto.La transfección con Bic facilita la visualización de neuronas individuales en un fondo limpio de células no transfectadas. En este video, demostramos un método para fabricar balas de cañón genético recubiertas con ADN y luego realizar la transfección con Bic en cultivos organotípicos de secciones del hipocampo. Hola, soy Georgia Woods.Soy estudiante de posgrado en el laboratorio de la Dra. Karen Zito en la Universidad de California en Davis. Hoy demostraré cómo preparar balas recubiertas con ADN y cómo realizar la transfección Bic en cortes de hipocampo de rata. Los pasos básicos de la transfección Bic consisten en: primero, recubrir partículas de oro con el ADN que se va a transfectar; segundo, recubrir el interior del tubo plástico con este oro; tres.Corte el tubo en cartuchos para cargar en la pistola génica y cuatro, y dispare sobre el tejido que se va a transfectar. Así que comencemos. Antes de que estemos listos para transfectar, primero necesitamos preparar las balas recubiertas con ADN.Esto implicará recubrir partículas de oro de 1,6 micrones con el plásmido de ADN que se va a transfectar. Durante el disparo, una partícula individual de oro actuará como la bala que penetrará la célula, provocando la transfección. Por lo tanto, primero necesitamos preparar el ADN que se va a transfectar.En condiciones ideales, se debe utilizar menos de 50 microgramos de ADN por cada conjunto de balas en un volumen total de 50 microlitros de agua. Tenga en cuenta que la cantidad exacta de ADN que se debe usar debe determinarse empíricamente para cada construcción, según el nivel óptimo de expresión obtenido. Ahora que tenemos nuestra alícuota de ADN, necesitamos agregar espermina a las perlas de oro.Añada a los ocho mg de oro previamente pesados, cien microlitros de esperma, meine y sonicar durante aproximadamente 20 segundos. Es esperma.La meina es una poliamina que carga positivamente el oro, lo que permite la interacción con el ADN cargado negativamente mediante el metal cargado positivamente. Después del hijo 22, agregue la solución acuosa de ADN de 50 microlitros al oro. Una vez que el ADN se haya agregado a las perlas, agite en vórtex mientras añade cien microlitros de cloruro de calcio gota a gota; el cloruro de calcio provoca la precipitación del ADN.Después de agitar brevemente en vórtex, dejar que la solución se precipite durante 10 minutos. Después de la precipitación de 10 minutos, centrifugar el ADN y el oro a máxima velocidad durante 30 segundos en una centrífuga de mesa; tras la 32.ª centrifugación a alta velocidad, eliminar por pipeteo la mayor parte del sobrenadante, pero evitando aspirar el botón de oro. En este momento, simplemente estoy eliminando cualquier ADN que no se haya precipitado sobre el oro.Las partículas de oro se lavan luego en un mililitro de etanol completamente nuevo y se someten a sonicación brevemente. Una vez que el ADN precipita, tiende a hacer que el oro se aglomere. Una sonicación ligera deshace estos agregados de oro. Pero tenga cuidado de no romper el ADN por una sonicación excesiva.Los pellets de oro se centrifugan nuevamente y el etanol se elimina por pipeteo. Repita el lavado con etanol otras dos veces. Después del tercer lavado con etanol, agregue 200 microlitros de la solución diluida de polivinilpirrolidona o PVP y someta a sonicación.Transfiera brevemente el oro recubierto a un tubo cónico de 15 mil que ya contenga 200 microlitros de solución diluida de PVP. El PVP es un solvente que hará que las partículas de oro se adhieran a los tubos de plástico utilizados. En el siguiente paso, elimine los rastros de perlas de oro que permanecen en el tubo epivacuolario añadiendo 200 microlitros de PVP al tubo epi.Luego, agitar brevemente y transferir al tubo cónico de 15 ml. Repita este paso hasta que todo el oro se haya transferido al tubo cónico de 15 ml. Transfiera la solución restante de PVP para que el oro quede resuspendido en una solución de 3,2 ml de PVP en etanol.Ahora estamos listos para recubrir el tubo de plástico que se utilizará para alojar las balas del cañón genético cuando se carguen en el mismo. Dado que el oro ya está recubierto con ADN, necesitamos revestir el interior del tubo de plástico con las partículas de oro. Este tubo de plástico recubierto de oro es lo que realmente se cargará en el tubo del cañón genético.Comience, corte un trozo de tubo de modo que se extienda aproximadamente dos pulgadas más allá del anillo O. Una vez que el tubo se haya colocado en la estación de preparación de tubos, gire la válvula de presión para que el medidor de flujo marque aproximadamente 0,4. El nitrógeno proporciona una atmósfera libre de agua para secar el tubo; seque el tubo durante unos 20 minutos.Es mejor realizar este paso de secado mientras recubre las balas de oro con ADN, como se mostró en el paso anterior. De esta manera, el tubo estará seco y listo para ser recubierto una vez que haya terminado. Preparar ahora las perlas de oro ahora que el tubo está seco y que el oro ha sido recubierto con el ADN.Apague la estación N dos antes de llenar el tubo con su solución de PVP-oro y retire el tubo seco de la estación y conéctelo a una jeringa de 10 mil antes de aspirar el PVP y el oro hacia el interior del tubo. Agite bien la solución e inmediatamente aspirarla hacia el interior del tubo seco, evitando burbujas. Además, tenga cuidado de no aspirar la solución hacia el interior de la jeringa.Con el tubo ahora lleno con la solución de oro PVP, coloque cuidadosamente el tubo nuevamente en la estación N dos. Deje reposar la solución durante cinco minutos con la jeringa conectada para que las partículas de oro sedimenten en la parte inferior del tubo. Marque los extremos del tubo donde se asienta la solución.Después de que la solución se asiente, será visible una franja de oro en la parte inferior del tubo utilizando la jeringa adjunta. Retire el sobrenadante muy lentamente, asegurándose de no provocar un lavado inverso ni desconectar el tubo. Ahora debemos rotar y secar el tubo para adherir el oro de manera uniforme en toda la superficie interna del tubo.Primero, gire el tubo 90 grados. Espere dos segundos. Ahora gire otros 180 grados y espere otros dos segundos.Gire cinco segundos y finalmente encienda el N dos para que la estación marque entre 0,4 y 0,5 y gire mientras el tubo se seca durante cinco minutos. Ahora que han pasado los cinco minutos y nuestro oro está seco, necesitamos cortar el tubo en cartuchos que puedan cargarse en la pistola génica. Ahora cortaré el tubo en secciones de aproximadamente media pulgada para fabricar las cápsulas que tendrán un tamaño adecuado para cargar en el cilindro de la pistola génica.Para recolectar las conchas, coloque la bilis de simulación de sello debajo del cortador, corte el tubo en las marcas y corte el tubo con una cuchilla limpia. Coloque el tubo en la cortadora de tubos para obtener una longitud adecuada. Simplemente avance el tubo hacia adelante hasta sentir resistencia y luego córtelo.Una vez que se ha cortado el tubo y recogido en el vial de centelleo, coloque una pastilla desecante en el vial de centelleo. Las balas son efectivas hasta seis meses, pero después de dos o tres meses pueden comenzar a mostrar una disminución en la eficiencia de transfección. Por lo tanto, es recomendable etiquetar el vial con el nombre del constructo y la fecha.Las balas pueden usarse inmediatamente después de prepararlas o pueden almacenarse a cuatro grados Celsius. Si está utilizando balas almacenadas a cuatro grados Celsius, deje que el vial de almacenamiento alcance la temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos antes de abrirlo, para evitar que las balas absorban humedad. Ahora estamos listos para disparar las balas de ADN utilizando una pistola génica.Ahora que las microperlas están preparadas, estoy listo para transfectar realmente las células. Utilizaré una pistola génica BioRad Helios y dispararé cortes de hipocampo de rata que han sido incubados durante cinco días desde su disección. La pistola génica estará conectada a un tanque de gas helio.Cuando se dispara el arma, un breve impulso de presión procedente del tanque acelerará las partículas de oro hacia el corte. En general, cuando una partícula de oro termina incrustada en el núcleo de la célula, dicha célula se vuelve transfectada.Dado que estoy realizando transecciones de cortes cultivados, empleo una técnica relativamente estéril durante toda la transfección con Bic para evitar contaminaciones. Una vez que los cartuchos se hayan calentado a temperatura ambiente, abra el vial de simulación y coloque los cartuchos de plástico recubiertos de oro en el soporte de cartuchos. A continuación, coloque el soporte de cartuchos en la pistola génica empujando primero hacia atrás el seguro del cilindro.Ahora es necesario fijar el revestimiento del cilindro al arma. Primero, asegúrese de que la junta tórica esté colocada en el revestimiento del cilindro y de que la pantalla difusora esté bien sujeta. La pantalla sirve para distribuir la presión desde el cilindro y conduce al rociado del oro, logrando una dispersión más uniforme del oro en el pocillo.Enrosque el revestimiento del cilindro completamente dentro de la pistola génica. Al disparar dos construcciones diferentes, ambos conjuntos de proyectiles pueden cargarse en el mismo portacartuchos, pero se debe cambiar el revestimiento del cilindro y la pantalla entre construcciones. La pistola génica ya está lista para ser conectada a la fuente de helio.Conecte la pistola génica a la manguera conectada al tanque de gas helio. Debe encajar en su lugar y suba la presión del tanque a 180 PSI. La pistola ya está lista para disparar, pero primero, recuerde usar protección auditiva y, para eliminar cualquier polvo o residuo de la pantalla difusora, dispare en blanco para accionar la pistola.Primero, presione el botón de seguridad hasta que la pistola emita un sonido y luego jale del gatillo. Ahora estamos listos para disparar la sección. Después de disparar la muestra en blanco, retire las secciones del incubador.Durante nuestras disecciones del hipocampo, colocamos cuatro secciones por pocillo y las organizamos de manera que formen las esquinas de un cuadrado de dos centímetros cerca del centro de la membrana. Ilumine cada pocillo con la pantalla difusora a aproximadamente media pulgada hasta una pulgada de distancia de la sección. Las células transfectadas suelen poder examinarse entre uno y cinco días después, dependiendo del constructo.Una vez que se hayan disparado todos los pozos, apague el gas y libere la presión antes de desconectar la pistola de la manguera de helio. Retire los cartuchos y las vainas usadas. Desatornille el forro del cañón; los cartuchos, los forros del cañón y las pantallas pueden limpiarse colocándolos en un baño de agua jabonosa y sometiéndolos a sonicación durante 20 minutos, enjuagándolos bien con agua, sumergiéndolos en etanol al 70 % durante una hora y luego colocándolos sobre una toalla de papel seca durante toda la noche.Los cartuchos y tamices limpios pueden reutilizarse entonces en transfecciones bióticas posteriores. Ahora veamos algunos de los resultados de la transfección. Incluso para una preparación estándar de cortes de hipocampo, puede haber un rango bastante amplio de eficiencias de transfección dependiendo de las microperlas y los cortes.Por lo general, es deseable una eficiencia de transfección relativamente baja para obtener neuronas transfectadas bien aisladas. Además, cuando se transfectan demasiadas células, se ve comprometida la salud general del corte en condiciones óptimas. Habitualmente hay menos de 20 células por corte, aunque a menudo otros cortes en el mismo pocillo terminan con muchas más células.Los cortes transfectados y otros acabarán con menos células. Las inconsistencias en la eficiencia de transfección entre cortes se deben generalmente al hecho de que la colocación de los cortes respecto al cilindro no era simétrica, o de que el oro no estaba uniformemente recubierto alrededor del tubo, sino concentrado en un lado. Si se transfectan demasiadas células, intente aumentar la distancia de disparo respecto a la muestra, disminuir la presión de disparo o reducir la cantidad de oro utilizada para fabricar las balas.Aquí puede observarse un excelente ejemplo de una neurona paramedial transfectada. En esta célula en particular, se puede ver una micropartícula de oro incrustada en la célula. Aquí hay una vista más detallada de una neurona transfectada. En ca uno, a veces el disparo puede provocar cortes no saludables.A menudo, las secciones poco sanas resultan del estallido de presión. El sistema de la pistola génica Helios incluye un difusor con una cruz metálica en su centro. Eliminamos la cruz metálica interna y en su lugar utilizamos una pantalla metálica en lugar de esta cruz.Simplemente cortamos la malla un poco más grande que el extremo del revestimiento del barril y la sujetamos entre el extremo del revestimiento del barril y el difusor cortado. Hemos descubierto que esto mejora la salud de los cortes. Además, las condiciones óptimas de disparo variarán según la preparación experimental; para optimizar diferentes preparaciones experimentales, varíe la presión del tanque de helio y la distancia de disparo respecto a la muestra.Finalmente, en caso de que desee utilizar partículas con dos constructos diferentes para una transfección dual, asegúrese de que ambos constructos estén bajo el mismo promotor. De este modo, un promotor no competirá con el otro. Acabo de mostrarle cómo preparar partículas para la biolística y cómo transfectar cortes hipocampales utilizando la transfección BIC.Este es un método sumamente potente para realizar estudios morfológicos en neuronas individuales que pueden ser observadas en aislamiento. Eso es todo. Gracias por ver y buena suerte con sus experimentos.

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Para llevar a cabo una evaluación rápida de la función de los genes en el desarrollo de la corteza cerebral, se describen procedimientos que implican...

Métodos de estudio de la morfogénesis neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporación en la corteza cerebral embrionario murino

Fuente: Keener, D. G., et al. Electroporación unicelular a través de diferentes cultivos de cortes organotípicos de neuronas inhibidoras excitadoras y específicas de clase del hipocampo de ratón. J. Vis. Exp. (2020).Este video demuestra el proceso de electroporación unicelular para introducir ADN plasmídico en las neuronas dentro de cultivos de cortes de hipocampo de ratón. El procedimiento implica un posicionamiento preciso de la pipeta, ajustes de presión y pulsos de electroporación para...

Expresión génica mediante electroporación unicelular en cultivos de cortes de hipocampo de ratón

Este video demuestra el protocolo para la electroporación de genes unicelulares en neuronas excitadoras e inhibidoras en una variedad de cultivos de cortes de hipocampo in vitro. La técnica es útil para examinar funciones moleculares y fisiológicas específicas de las neuronas, incluidos los mecanismos autónomos de las células y las interacciones transsinápticas de proteínas.

Electroporación de una sola célula en cultivos organotípicos de cortes de cerebro: una técnica in vitro para administrar plásmidos dentro de neuronas específicas en cortes de hipocampo cerebral

Fuente: Denaxa, M., el al., Trasplante de progenitores interneuronales corticales modificados quimiogenéticamente en cerebros de ratón posnatales tempranos. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el procedimiento para inyectar un vector plásmido que lleva el gen de interés en progenitores interneuronales en un corte de cerebro embrionario, seguido de electroporación para la entrada de plásmidos y la expresión génica. Estos progenitores modificados se pueden usar más tarde para tratar...

Transferencia de genes asistida por electroporación integrada en agarosa en progenitores de interneuronas corticales de ratón

Las recientes mejoras en las preparaciones organotípicas de cortes de cerebro han permitido su explotación para aplicaciones biotecnológicas. Los cortes organotípicos mantienen las características estructurales locales de la biología in vivo, incluidas las conexiones sinápticas funcionales. En este trabajo se presenta un método de administración biolística regioselectiva para etiquetar y manipular genéticamente estos cortes.

Regioselectiva biolística Focalización en Organotípicos cerebro rebanadas Usando una pistola de genes Modificado

Aquí se presenta un protocolo para la electroporación unicelular que puede entregar genes en neuronas excitatorias e inhibitorias a través de un rango de edades in vitro de cultivo de rebanadas de hipocampo. Nuestro enfoque proporciona una expresión precisa y eficiente de genes en células individuales, que se pueden utilizar para examinar las funciones intercelulares y autónomas de la célula.

Electroporación Unicelular A Través De Diferentes Cultivos Organotípicos Slice De Ratón Excitatorio Hipocampal Y Neuronas Inhibitorias Específicas De Clase

Aprende a preparar balas de genes recubiertas de ADN y realizar transfección biolística en neuronas de rebanadas de hipocampo de rata. Este método permite visualizar neuronas individuales con un fondo limpio para estudios de morfología.

Preparación de balas de cañón de genes y transfección biolística de neuronas en cultivo Cortar

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