Name: Etiquetado y hESCs hMSCs con nanopartículas de óxido de hierro para no invasivo en el seguimiento in vivo mediante RM (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-31T21:32:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprende a etiquetar células madre mesenquimales y embrionarias humanas con nanopartículas de óxido de hierro para su seguimiento no invasivo mediante resonancia magnética in vivo.

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Este proyecto fue financiado por una subvención Leon J. SEMILLA Thal del Instituto de Medicina Regenerativa de California. Tobias Henning fue financiado por una beca de investigación de la Asociación Alemana de Investigación (DFG, el Excmo 4578/1-2). Queremos reconocer y agradecer Meneses Juanito por sus consejos sobre la cultura de células madre embrionarias humanas.

Etiquetado de hMSC con Ferucarbotran Esta es la técnica para el etiquetado de las células madre mesenquimales con Ferucarbotran, un agente de contraste basados ​​en óxido de hierro de la RM: <ol><li> Para empezar, la placa de las células de 18-24 horas antes del procedimiento de etiquetado en frascos T75 en una confluencia del 80%. Si utiliza una placa de cultivo diferentes, esto es igual a cerca de 10.000 células por cm 2. </li><li> Al día siguiente, comenzar con la preparación de los medios de comunicación etiquetado mediante la adición de 30 l de Resovist a 8 ml de medio libre de suero. Esto marca un frasco T75 el 80% de confluencia, que corresponde a una concentración de 100 mg Fe / ml de los medios. </li><li> Quítese los medios de cultivo y se lavan las células una vez con PBS o medio libre de suero. Esto se hace para deshacerse de las proteínas del suero residual y otros componentes de los medios de comunicación que podría obligar a la agente de contraste y etiquetado de eficiencia influencia. </li><li> Añadir los medios de comunicación de etiquetado para el frasco y colocar el frasco de nuevo en la incubadora. </li><li> Después de 2 horas, añadir 2 ml de FCS para que una concentración final de 20% de FCS se logra. Esto se hace para asegurar que las células no reciben el estímulo para diferenciar, sino que crecen en su entorno familiar. </li><li> Se incuban las células durante 18 horas. Esto se hace mejor durante la noche. </li><li> Al día siguiente, lavar las células con PBS, y luego trypsinize como de costumbre. </li><li> Una vez trypsinized, la suspensión de células necesita ser lavado tres veces para deshacerse del agente residual, cambio libre en los medios de comunicación. Esto se hace con PBS las células centrifugando a 400 rcf durante 5 minutos. </li><li> La final precipitado de células pueden ser resuspendidas y está listo para nuevos experimentos. </li><li> Contar ahora las células, como algunos se han perdido durante los pasos previos de lavado. Además, realizar pruebas de viabilidad en este momento utilizando el ensayo de exclusión del azul tripano y tomar algunas muestras para el análisis de espectrometría de medir la eficacia de etiquetado. </li></ol> Etiquetado de células madre embrionarias humanas con Ferumoxides <ol><li> Para empezar, la placa de la células madre en los platos de 10 cm, como de costumbre. Estos platos se cubren con gelatina y tienen células irradiadas de alimentación en ellos. Usted puede usar este protocolo para la alimentación libre de culturas. </li><li> Deje que la células madre se adhieren y crecen por día aproximadamente 3-4 para que formen colonias de tamaño mediano. Durante este tiempo, asegúrese de que las colonias no crecen a grandes, como las colonias grandes son más difíciles de romper más tarde. </li><li> Células diferenciadas pueden contaminar los cultivos, por lo que dependiendo de la limpieza de las colonias, es posible que tenga que deshacerse de las culturas diferenciadas por la disección. </li><li> Prepare los medios de comunicación que consiste en el etiquetado de Ferumoxides a una concentración de los medios de comunicación células madre 100μg/ml y completa. Para ello, se mezcla 89μl Ferumoxides y 10 ml de medio de cultivo completo. </li><li> Lavar el plato una vez con los medios de comunicación completa. </li><li> Añadir 10 ml de etiquetado de medios por placa e incubar las células durante 4 horas. </li><li> Ahora, el etiquetado es completo. En el siguiente paso, es necesario lavar las células y obtener una suspensión de células individuales para su uso posterior. Para ello, primero enjuague el recipiente con PBS. </li><li> A continuación, reemplace el PBS con 5 ml de tripsina 0,25% y se incuban en la incubadora durante 5 minutos, o hasta que separar las células. Esto ayuda a aprovechar el plato con frecuencia. </li><li> Las células han separado. Tenga en cuenta que si el plato contenía grandes colonias que podría haber algunos grupos a la izquierda. </li><li> Para deshacerse de estos grupos, se puede mezclar la suspensión toda vez que con una pipeta serológica, luego dejar reposar por 2 minutos. </li><li> No usar una pipeta Eppendorf, chupando como repetida de las células a través de la punta delgada puede romper las membranas celulares. </li><li> Si matas residual están presentes, se puede ejecutar la suspensión de células a través de un filtro de 40μm celular. </li><li> Si todo ha funcionado correctamente, una suspensión de células individuales ahora existe, que se mezcla con un montón de escombros, procedentes de la capa de gelatina, el CES-matriz y las células muertas. Para deshacerse de este, se lavan las células dos veces al girar hacia abajo a 400 rcf durante 5 minutos y volver a suspender en los medios de comunicación completa. </li><li> Ahora, el CES tiene que ser aislado de las células irradiadas de alimentación. Esto se puede hacer de manera eficiente por la chapa de la suspensión de células en un plato recubiertas de gelatina. </li><li> Si el plato no se manipula, todas las células se sedimentos hacia abajo, pero los alimentadores se conectará más rápido que la ESC. </li><li> Por lo tanto, si el sobrenadante se retira después de 45 minutos, que debe contener todo ESC, mientras que los alimentadores de todo debe atribuirse a la antena. </li><li> De esta manera, una suspensión de células individuales de marcadas magnéticamente las células madre de embriones humanos que se pueden utilizar para más experimentos se obtiene. </li><li> Al igual que en el protocolo anterior, en este punto, es necesario contar con las células y tomar muestras para la evaluación de la viabilidad y la medición de la eficacia de etiquetado. </li></ol>

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Hematopoietic+Progenitor+Cells+with+MR+Contrast+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents.</a> 228, 760-767 (2003).</li>
<li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+iron+oxide+labeled+human+hematopoietic+progenitor+cells+in+a+xenotransplant+model%3A+in+vivo+monitoring+using+clinical+magnetic+resonance+imaging+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment.</a> Radiology. 234, 197-205 (2005).</li>
<li>Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+labeling+with+the+positive+MR+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Gadofluorine+M.+Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell labeling with the positive MR contrast agent.</a> Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).</li>
</ol>

Una representación no invasiva de las células madre es crucial para el seguimiento prácticamente cualquier terapia con células madre basado. Una mejor comprensión de la cinética en vivo de las células madre etiquetado, tal como puede verse en las imágenes de RM, podría abrir el camino a un racional y un uso más eficaz de células madre basado en las terapias. Desde que usamos los agentes de contraste aplicación clínica y las técnicas de imagen, los protocolos presentados deben ser fácilmente traducibles a las aplicaciones en los pacientes. L...

<table><tbody><tr><td>D-MEM con alta glucosa</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>diluir gelatina en PBS hasta una concentración final de 0,1 %</td></tr><tr><td>PBS (libre de Ca++ y Mg++)</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,05 %</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25 %</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal caracterizado</td><td>Reactivo</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Filtro celular (40 &amp;mu;m de nailon)</td><td>Herramienta</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Sustituto de suero Knockout</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>aminoácidos no esenciales</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Reactivo</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Reactivo</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ferumoxidas (Endorem)</td><td>Reactivo</td><td>Guerbet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferucarbotrano (Resovist&amp;#174;)</td><td>Reactivo</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

etiquetado y hescs hmscs con nanopartículas de óxido de hierro para no invasivo en el seguimiento in vivo mediante rm

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

En los últimos años, la investigación con células madre ha dado lugar a una mejor comprensión de la biología del desarrollo, diversas enfermedades y su impacto potencial en medicina regenerativa. Un método no invasivo para monitorizar las células madre trasplantadas en varias ocasiones en vivo aumentaría en gran medida nuestra capacidad para comprender los mecanismos que controlan la muerte celular del tallo e identificar los factores tróficos y las vías de señalización que mejoren el injerto de células madre. RM ha demostrado ser una herramienta eficaz para la representación en vivo de las células madre con una resolución de cerca de anatomía microscópica. Con el fin de detectar las células madre con retraso mental, las células tienen que estar etiquetados con células específicas de los agentes de contraste RM. Para ello, las nanopartículas de óxido de hierro, como las partículas de óxido de hierro superparamagnético (SPIO), se aplican, debido a su alta sensibilidad para la detección de células y su excelente biocompatibilidad. SPIO partículas están compuestas de un núcleo de óxido de hierro y una capa de dextrano, carboxidextrano o almidón, y la función mediante la creación de heterogeneidades locales de campo, que causan una disminución de la señal en imágenes potenciadas en T2 MR. En esta presentación se muestran las técnicas para el etiquetado de las células madre con agentes de contraste para RM aplicación clínica posterior no invasivo en el seguimiento in vivo de las células marcadas con la RM.

Para la evaluación de nuevas terapias con células madre es importante no invasiva vía las células inyectadas en vivo. Este video le mostrará cómo etiquetar células madre mesenquimales humanas embrionarias y con los agentes de contraste basados ​​en óxido de hierro en vivo para su posterior RM en vivo.

Etiquetado y hESCs hMSCs con nanopartículas de óxido de hierro para no invasivo en el seguimiento in vivo mediante RM

En los últimos años, la investigación con células madre ha permitido una mejor comprensión de la biología del desarrollo, de diversas enfermedades y de su impacto potencial en la medicina regenerativa...

Bienvenido al laboratorio del Dr. Haiku Dal Link. Queremos agradecer al Instituto de Medicina Regenerativa de California por financiar este proyecto para la evaluación de nuevas terapias con células madre. Es importante rastrear de forma no invasiva las células inyectadas in vivo.Esto es posible mediante la marcación de las células in vitro con agentes de contraste específicos o multifuncionales para imágenes por resonancia magnética o imágenes ópticas. Este video le mostrará cómo marcar células madre mesenquimales humanas y células madre embrionarias humanas para su posterior obtención de imágenes in vivo. Hola, soy Tobias Henning del Grupo de Investigación de Agentes de Contraste en el Centro de Imagen Molecular y Funcional del Departamento de Radiología de la Universidad de California en San Francisco.Hoy voy a mostrarle los procedimientos para la marcación in vitro de células madre mesenquimales humanas con peric, carone, y de células madre embrionarias humanas con óxidos de phem. Esta técnica es útil para localizar las células inyectadas in vivo o para obtener información acerca de su estado funcional. Los procedimientos para la marcación celular con agentes de contraste para

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Investigación

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Biología

Este video muestra las técnicas para el etiquetado de las células madre embrionarias y células madre mesenquimales con tintes fluorescentes. Esta técnica se puede utilizar para un seguimiento in vivo de las células madre trasplantadas con técnicas de imagen óptico y de las correlaciones histopatológico con microscopía de fluorescencia.

Etiquetado de las células madre con tintes fluorescentes para la detección no invasiva con imágenes ópticas

En este vídeo, se muestra como etiqueta de células madre embrionarias humanas (células madre) con cloruro de manganeso...

En el etiquetado in vitro de células estaminales embrionarias humanas de Resonancia Magnética

Objetivo de la presentación es mostrar un método altamente reproducible para generar la matriz asociada implantes de células madre en los defectos del cartílago, que puede ser visualizado con RM. Las células madre son etiquetados con aprobación de la FDA Ferumoxides, mezclado con agarosa, se implantan en los defectos del cartílago y la imagen con un escáner de MR 7T.

Implantación de Ferumoxides Etiquetada células madre mesenquimales humanas en los defectos del cartílago

Los métodos utilizados para evaluar Bioimagen biodistribución de células de las nanopartículas son aplicables para el seguimiento terapéutico y de diagnóstico de los compuestos nanoformulated. Los métodos descritos en este documento son sensibles y específicos cuando se evaluó por corregistro histológico. Las metodologías de proporcionar una vía de traslación de los roedores a aplicaciones humanas.

Bioimagen registradas de Nanomateriales para el Monitoreo de Diagnóstico y Terapéutica

Se describe una técnica para el etiquetado y el seguimiento de las células madre aprobados por la FDA, superparamagnéticas de óxido de hierro (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Esta técnica de imagen celular que utiliza la resonancia magnética (RM) para la visualización, es fácilmente accesible para su seguimiento a largo plazo y el diagnóstico de engraftments células madre con o sin éxito en los pacientes.

Etiquetado de las células madre con Ferumoxytol, uno de nanopartículas de hierro aprobada por la FDA de óxido

En este artículo se describe una secuencia optimizada de eventos para obtener imágenes multimodal de los injertos celulares en el cerebro de los roedores por medio de: (i) en la bioluminiscencia in vivo y la resonancia magnética, y (ii) el análisis post mortem histológico. La combinación de estas modalidades de imágenes en un solo animal permite la evaluación del injerto celular con alta resolución, sensibilidad y especificidad.

Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

El seguimiento de las células utilizando MRI ha ganado la atención notable en los últimos años. Este protocolo describe el etiquetado de las células dendríticas con flúor...

De las Migraciones células dendríticas mediante resonancia 19F / 1H Magnetic

Detalles del Protocolo se proporcionan para etiquetado células embrionarias humanas in vitro madre con segunda nanopartículas que generan armónicos. También se presentan metodologías para la investigación de células madre mediante microscopía multi-fotón y su diferenciación en grupos cardíacas.

Armónica Nanopartículas para Regenerativa de Investigación

Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

La administración celular dirigida es útil en una variedad de aplicaciones biomédicas.  El objetivo de este protocolo es utilizar nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro (SPION) para marcar células y, por lo tanto, permitir enfoques de orientación de células magnéticas para un alto grado de control sobre la entrega y localización de células.

Etiquetado Celular y Orientación con superparamagnético nanopartículas de óxido de hierro

Aquí se presenta un protocolo para la entrega y seguimiento de células madre mesenquimales no invasivas (MSC) en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática. Las nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético se emplean como una sonda de resonancia magnética (RM) para el etiquetado de MSC y el seguimiento in vivo no invasivo después de la administración intranasal mediante RMN en tiempo real.

Seguimiento de células madre mesenquimales con etiqueta de óxido de hierro superparamagnético mediante RMN después de la entrega intranasal en un modelo de murino de lesión cerebral traumática

Aprende a etiquetar células madre mesenquimales y embrionarias humanas con nanopartículas de óxido de hierro para su seguimiento no invasivo mediante resonancia magnética in vivo.

Etiquetado y hESCs hMSCs con nanopartículas de óxido de hierro para no invasivo en el seguimiento in vivo mediante RM

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