Att mäta lungfunktion hos möss med Ohämmad Hela kroppen pletysmografi
Summary
Bedömningen av andningsfysiologi har traditionellt förlitat sig på teknik, som kräver återhållsamhet eller sedering av djuret. Ohämmad helkropps pletysmografi tillhandahåller emellertid exakt, icke-invasivt, kvantitativ analys av andningsfysiologi i djurmodeller. Dessutom gör tekniken upprepade andnings bedömning av möss som möjliggör longitudinella studier.
Abstract
Andnings dysfunktion är en av de främsta orsakerna till sjuklighet och dödlighet i världen och dödligheten fortsätter att stiga. Kvantitativ bedömning av lungfunktionen i gnagarmodeller är ett viktigt verktyg i utvecklingen av framtida behandlingar. Vanligt använda metoder för att bedöma andningsfunktion inklusive invasiv pletysmografi och tvångs svängning. Även om dessa tekniker ge värdefull information, kan datainsamling vara förenat med artefakter och experimentell variation på grund av behovet av anestesi och / eller invasiv instrumentering av djuret. Däremot ohämmad hela kroppen pletysmografi (UWBP) erbjuder en exakt, icke-invasiv, kvantitativt sätt genom att analysera andningsparametrar. Denna teknik undviker användningen av anestesi och begränsningar, som är gemensam för traditionell pletysmografi tekniker. Denna video kommer att visa UWBP förfarandet inklusive utrustning inrättas, kalibrering och lungfunktion inspelning. Detkommer att förklara hur man analyserar insamlade data, samt identifiera experimentella extremvärden och artefakter som är resultatet av djurförflyttningar. Andnings parametrarna, som erhölls med denna teknik inkluderar tidalvolym, minutvolym, inandningsarbetscykel, inandningsflödet och förhållandet mellan inspiration då och förfallotiden. UWBP inte förlitar sig på specialiserade kunskaper och är billig att utföra. En viktig egenskap hos UWBP och mest tilltalande för potentiella användare, är förmågan att utföra upprepade mätningar av lungfunktionen på samma djur.
Introduction
Lung dysfunktion är en av de främsta orsakerna till sjuklighet och dödlighet i världen. Tillståndet kännetecknas av bristande syreutbyte, synonymt med hosta, bröstsmärtor och andnöd. Andnings konton sjukdoms för ~ 10% av dödligheten i världen 1. Enligt Världshälsoorganisationen, är dödligheten kommer att öka på grund av ihållande rökning, föroreningar och yrkes irriterande. UWBP är ett bra komplement för att studera lungfysiologi, som starkt komplimanger traditionella biokemiska och histologiska analyser 2. Andra metoder som används för lung bedömning ger inte samma fördelar som UWBP. Invasiv pletysmografi är en vanligt förekommande teknik som kräver att djur som ska anestesi 3,4 och därmed resulterande andnings mätningar inte nödvändigtvis reflekterar ett naturligt tillstånd. Vidare kravet på mekanisk ventilation och kemiska utmaningar utesluter framtida mätningar 3,4.En annan metod för att samla in andningsdata är genom påtvingad svängning, vilken är mer känslig för finare förändringar i respiratoriska parametrar jämfört med UWBP 5. Tvingad svängning är dock en invasiv teknik och kräver djur uppsägning för datainsamling 5-7.
UWBP innebär att placera ett djur i en specialiserad kammare. Under inspiration, är det tidvatten luften värms och fuktas i lungorna ökar vatten ångtryck och orsakar termisk expansion av gas 8. Denna effekt orsakar en nettoförändring i luftvolymen skapar en ökning av trycket inuti pletysmografen kammaren 8. Det motsatta inträffar under utandning skapar en andningsvågform från djuret. Wave analys används sedan för att mäta från andnings spår: andningsfrekvens (andetag / min), total andningscykel (sek), inspiration / utgångstiden (Ti / Te, sek) och förändringar i tryck på grund av varje tidalvolym (P T). <strong> Figur 1 visar varje mätning ursprung från en andnings spår. Dessa mätningar är enkla att beräkna och flera andningsparametrar kan härledas från dessa mätningar. Dessa parametrar inkluderar: Tidal volym (volymen luft flyttas mellan normal inandning och utandning), minutvolym (volym gas inhaleras från lungorna per minut), inandningsarbetscykel (andelen inspiration tid till den totala andningscykeln varaktighet) och inandningsflöde (mängden luft som inspireras i en viss tid).
UWBP ger exakt, icke-invasiv, kvantitativ analys av andningsfysiologi i djurmodeller och kan användas för att mäta utvecklingen av luftvägssjukdomar och lungfunktion 6,9. I motsats till andra pletysmografi tekniker, UWBP undviker användningen av anestesi, begränsningar och invasiva manipulationer som producerar artefakter och experimentell variabilitet 6,9. Anestesi kan undertrycka andning,förändrar hjärtfrekvens och kan vara en utmaning att reglera 10. Begränsningar inducerar en ökning av andningen på grund av ytterligare stress via kortikosteron och adrenalin släpper 11,13. Det viktigaste inslaget i UWBP upprepas fysiologisk bedömning gör den mottaglig för longitudinella studier. UWBP rekommenderas starkt för längsgående bedömning av lungfysiologi och erbjuder en värdefull färdighet för framtida andningsdrogbedömning.
Bleomycin, ovalbumin, och hypoxi har använts för att inducera utmaningar respirator i flera studier och UWBP har framgångsrikt mätas exakt lunga fysiologisk bedömning 7,9,13-16. Protokollet som beskrivs är avsedd för vanliga vuxna laboratoriemöss. Emellertid har UWBP anpassats till andra djur, såsom råttor, marsvin, och icke-mänskliga primater 17-20. UWBP är inte begränsad enbart till att bedöma pulmonell dysfunktion, men har också använts för bedömningen av lungmognad 3.Den mångsidighet, enkelhet och reproducerbarhet UWBP har etablerat en utmärkt teknik för att bedöma lungfunktionen hos djur. Olika program (se material och utrustning tabell) kommer att krävas för att följa den här proceduren. En erfaren vetenskapsman skulle kunna utföra detta protokoll med en mus inom 1 timme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den teknik som beskrivs här är en icke-invasiv metod för utvärdering av andningsparametrar för ohämmade och obedövade möss. Styrkan i detta protokoll omfattar dess enkelhet och precision för att mäta lungfunktionen i längsled med minimala artefakter. Det finns dock vissa begränsningar och kritiska steg noteras om förfarandet. Först och viktigast, måste musen vara lugn i kammaren i minst fem sekunder. Inkom stressen kommer att störa andningsmönster av musen och därmed ge varierande resultat (fig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Prof David Walker for his technical advice and provision of equipment in the development of this technique. This work is supported by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program. This work was partly supported by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Materials
| LabChart 7 software (for Macintosh) | ADINSTRUMENTS | MLU60/7 | used in protocol step 4 |
| PowerLab 8/30 (model ML870) | ADINSTRUMENTS | PL3508 | |
| Octal Bridge Amp (model ML228) | ADINSTRUMENTS | FE228 | |
| Black BNC to BNC cable (1m) | ADINSTRUMENTS | MLAC01 | |
| Macintosh OS | Apple Inc. | – | Mac OS X 10.4 or later |
| Surgipack Digital Rectal Thermometer | Vega Technologies | MT-918 | |
| Grass volumeteric pressure transducer PT5A | Grass Instruments Co. | Model number PT5A; serial No. L302P4. | |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309628 | |
| 5ml serological syringe pipettes | Greiner Bio One | 606160 | Connected via plastic tubing |
| Balance/Scales | VWR International, Pty Ltd | SHIMAUW220D | Any weighing balance with of 0.1 gram resolution |
| HM40 Humidity & temperature meter | Vaisala | HM40A1AB | |
| Barometer | Barometer World | 1586 | |
| Laboratory tubing | Dow Corning | 508-101 | Used to connect water column to the syringe and pressure transducer |
| Cylindrical Perspex Chamber | Dynalab Corp. | Custom built cylindrical chamber with internal dimensions as follows: 50mm(w) x 1500mm(l). There are two lids for each side, with dimensions 80mm(l) x 80mm(w). Each lid has a 60mm wide circular hole cut on the face of the lid 50mm deep. This allows the chamber to fit into the lid. A rubber ring is fitted around each hole of the lid where the chamber will fit. For attachment of syringe and pressure transducer, the openings are 5mm in diameter. For attachment of humidity probe, the openings are 25mm in diameter. | |
| 80% Ethanol (4L) | VWR International, Pty Ltd | BDH1162-4LP |
References
- . . World Health Organization, World Health Statistics. , (2008).
- Jones, C. V., et al. M2 macrophage polarization is associated with alveolar formation during postnatal lung development. Respir. Res. 14 (41), 14-41 (2013).
- Campbell, E., et al. Stem cell factor-induced airway hyperreactivity in allergic and normal mice. Am. J. Pathol. 154 (4), 1259-1265 (1999).
- Card, J. W., et al. Cyclooxygenase-2 deficiency exacerbates bleomycin-induced lung dysfunction but not fibrosis. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 37 (3), 300-308 (2007).
- Berndt, A., et al. Comparison of unrestrained plethysmography and forced oscillation for identifying genetic variability of airway responsiveness in inbred mice. Physiol. Genomics. 43 (1), 1-11 (2011).
- Flandre, T., et al. Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice. J. Appl. Physiol. 94 (3), 1129-1136 (2003).
- Petak, F., et al. Hyperoxia-induced changes in mouse lung mechanics: forced oscillations vs. barometric plethysmography. J. Appl. Physiol. 90 (6), 2221-2230 (2001).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Milton, P. L., Dickinson, H., Jenkin, G., Lim, R. Assessment of respiratory physiology of C57BL/6 mice following bleomycin administration using barometric plethysmography. Respiration. 83 (3), 253-266 (2012).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53 (1), 55-69 (2012).
- Hildebrandt, I., et al. Anesthesia and other considerations for in vivo imaging of small animals. ILAR J. 49 (1), 17-26 (2008).
- Meijer, M. K., et al. Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice. Lab Anim. 40, 382-391 (2006).
- Hamelmann, E., et al. Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (3), 766-775 (1997).
- Lim, R., et al. Human mesenchymal stem cells reduce lung injury in immunocompromised mice but not in immunocompetent mice. Respiration. 85 (4), 332-341 (2013).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent Bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20, 909-923 (2011).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Wichers, L. B., et al. A method for exposing rodents to resuspended particles using whole-body plethysmography. Part. Fibre Toxicol. 13 (12), (2006).
- Chong, B. T. Y., et al. Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39 (3), 163-168 (1998).
- Lizuka, H., et al. Measurement of respiratory function using whole-body plethysmography in unanesthetized and unrestrained nonhuman primates. J. Toxicol. Sci. 35 (6), 863-870 (2010).
- McGregor, H., et al. The effect of prenatal exposure to carbon monoxide on breathing and growth of the newborn guinea pig. Pediatr. Res. 43, 126-131 (1998).
- Lundblad, L., et al. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Bartlett, D., Tenney, S. M. Control of breathing in experimental anemia. Respir. Physiol. 10 (3), 384-395 (1970).
- Malan, A. Ventilation measured by body plethysmography in hibernating mammals and in poiiulotherms. Respir. Physiol. 17 (1), 32-44 (1973).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respir. Physiol. 129 (3), 297-305 (2002).
- DuBois, A. B., et al. A new method for measuring airway resistance in man using a body plethysmograph: Values in normal subject and in patients with respiratory disease. J. Clin. Invest. 35 (3), 327-335 (1956).
- Enhorning, G., et al. Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals. Can. J. Physiol. Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).
- Zhang, Q., et al. Does unrestrained single-chamber plethysmography provide a valid assessment of airway responsiveness in allergic BALB/c mice. Respir. Res. 10 (61), (2009).
