Beredning av encelliga Suspensioner från musmjälte med gentleMACS Dissociator

Summary

Denna video beskriver ett enkelt, tidsbesparande teknik för automatiserad vävnadsdissociering använda gentleMACS Dissociator att förbereda encelliga suspensioner av musen splenocytes.

Abstract

Encelliga suspensioner är en förutsättning för experiment i cell separation, cell analys och cellodling. För att undvika tråkiga och ofta smärtsamma manuell dissociations de gentleMACS Dissociator gör att man kan separera vävnad mycket effektivt under kontrollerade och reproducerbara förhållanden. Den gentleMACS Dissociator kan optimalt avstånd musen mjälte, som kombinerar tidsbesparande och standardisering med användar-säkerhet. Denna video beskriver hur man särskilja musen mjälte med gentleMACS Dissociator, en automatiserad bänkbaserade enhet som mekaniskt kan störa vävnader med hjälp av speciella rör för att producera livskraftiga cellsuspensioner. Efter dissociation, är mjälte filtreras, centrifugeras och återsuspenderade för ytterligare applikationer.

Protocol

Introduktion till utrustning Tissue är försiktigt dissocierade, med violett C Rör till livskraftiga encelliga suspensioner. PBS / BSA-EDTA buffert används för att skilja cellerna. Bufferten är beredd genom att lägga till en del av BSA stamlösning till 20 delar autoMACS Sköljning Lösningar innehållande EDTA. Den MACS försepareringen filter används så att de dissocierade vävnadsprover är fria från alla celler klumpar, främja framgångsrika MACS separation och efterföljande analys. Ta avstånd de mjältceller Hela mjälte är disscociated i encelliga suspensioner av splenocytes använda gentleMACS Dissociator. Till att börja proceduren, ladda C Tube med en volym buffert enligt massan av mjälte. En frisk mjälte om en ung vuxen hona BALB / c mus väger ca 80-120 mg. Varje 1 till 2 mjälte av denna vikt kräver 3 ml buffert. Mjälte från äldre djur eller djur med infektioner är ofta större och måste vägas i buffert. Bufferten volymer måste anpassas i enlighet därmed. Inte överstiga buffert volym på 10 ml. Lägg till dissekerade mjälten till C Tube innehållande 3 ml buffert. Se till att C Tube locket är tätt och fäst C Tube till dissociator med locket nedåt. Effekt upp dissociator. För 1-2 mjälte, välja program m_spleen_01. Programmet tar 56 sekunder att genomföra. Om antalet mjälte är större, använder programmet m_spleen_04, detta program kan användas för upp till 720 mg mjälte vävnad. Efter genomgången av programmet den infödda mjälten vävnaden är dissocierade till en splenocyte suspension. Spinn ner hela cellsuspension på 300xg i rumstemperatur i ca 30 sek. Detta kommer att säkerställa att rotor och stator är befriad från alla celler som samlas i botten av C Tube. Ta provet genom membranet förslutna öppning i C Tube locket med hjälp av en 1000 mikroliter pipetter. Filtrering steg För att börja filtrering steg tillämpa dissocierade vävnaden till försepareringen filter eller en cell sil med 30 ìm porstorlek. Silen bör passa ett 15 ml rör för 1-2 mjälte eller en 50 ml tub i mer än 2 mjälte. Låt cellsuspension passera. Sedan tvätta filtret genom att 5 ml buffert. Nu, centrifugera röret med cellsuspension på 300xg, i rumstemperatur i 10 minuter för att samla alla splenocytes i en mjälte cellpellet. Nu när vi har en pellet av dissocierade splenocytes måste vi aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i en lämplig mängd buffert. Spleen dissociation använder gentleMACS Dissociator kommer att ge en hög andel av livskraftiga splenocytes, vilket framgår av flödescytometri med MACSQuant Analyzer. Döda celler färgas av propidiumjodid. I den medföljande exempel visar framåt Side Scatter dot plot den förberedda splenocytes.

Discussion

För att undvika tråkiga och ofta smärtsamma manuell dissociations tillåter gentleMACS Dissociator en att skilja vävnad mycket effektivt under kontrollerade och reproducerbara förhållanden. Det vävnadsdissociering förfarandet är skonsam mot cellerna och ger suspensioner cell med en hög lönsamhet takt. Den gentleMACS Dissociator i kombination med C Rör är utformad för beredning av encelliga suspensioner från olika vävnader. Instrumentet är utrustat med ett antal förinställda program att skilja mus mjälte, lever, lungor eller nervvävnad. Utbudet av program och protokoll kommer kontinuerligt att utökas till att omfatta ytterligare vävnader.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
gentleMACS™ Starting Kit		Miltenyi Biotec	130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
C Tubes		Miltenyi Biotec	130-093-237	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
13 mL Tubes		Miltenyi Biotec	130-091-596	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution		Miltenyi Biotec	130-091-222	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution		Miltenyi Biotec	130-091-376	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
Pre-Separation Filters		Miltenyi Biotec	130-041-407	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
MACSQuant Analyzer		Miltenyi Biotec	130-092-197
Propidium Iodide Solution		Miltenyi Biotec	130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx