AMフラ-2を用いて皮質ニューロンのカルシウムイメージング
Summary
カルシウムの信号は、遺伝子発現、生存と分化を含む多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。ここでは、フラ-2回答を使用して、カルシウムのイメージングを実行する方法を示します。カルシウムイメージングでは、リアルタイムとシグナル伝達カスケードの調節における細胞内カルシウムの調節を研究する貴重なツールです。
Abstract
カルシウムイメージングでは、培養細胞でのカルシウム信号を測定するための有用な一般的な手法です。カルシウムイメージング技術は、Ca2 +イオンの結合に応答してそれらのスペクトル特性を変更するBAPTA系有機分子であるカルシウム指示薬染料、を活用する。カルシウム指示薬染料は、二つのカテゴリーにレシオメトリックフラ-2のような染料とインド- 1とみたFluo – 4のような単一波長の色素を落ちる。レシオメトリック色素は、細胞内カルシウムの濃度が異なる波長で蛍光発光または励起の比から決定できるように、カルシウムに反応して励起またはそれらの発光スペクトルのいずれかを変更する。単一波長のプローブを介してレシオメトリック染料を使用する主な利点は、比の信号が色素濃度、照度、および独立してこれらのアーティファクトの決定する細胞内カルシウムの濃度を可能にする光路長に依存しないということです。最も一般的なカルシウムの指標の一つは、結合カルシウムに反応して発光505 nmにピークと380nmへの変更は340 nmからの励起ピークを有するフラ-2、です。ここでは、ニューロンや他の興奮性細胞の細胞内カルシウムの上昇を測定するためのフラ-2の使用について説明します。
Protocol
Discussion
このプレゼンテーションでは、AMフラ-2を使用してカルシウムのイメージングを行うためのすべてのステップを経てきました。我々はモデルとして皮質ニューロンを用い、カルシウムイメージングは、細胞の様々なリアルタイムで細胞内のカルシウムを測定するために使用することができます。この手順を行う際にはプラスチックが多くの場合、イメージングが困難に紫外波長、少なくとも蛍光灯なので…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | EM Science | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | SIGMA | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, . A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, . Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, . Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
