Imagem de cálcio dos neurônios corticais usando Fura-02:00
Summary
Sinais de cálcio desempenham um papel fundamental em muitos processos celulares, incluindo a sobrevivência de expressão gênica e diferenciação. Aqui demonstramos como realizar imagens de cálcio usando Fura-2 AM. Imagem de cálcio é uma ferramenta valiosa para estudar a regulação do cálcio intracelular em tempo real e de sua regulamentação de cascatas de sinalização.
Abstract
Imagem de cálcio é uma técnica comum, que é útil para medir sinais de cálcio em células em cultura. Técnicas de imagem de cálcio tirar proveito de corantes de cálcio indicador, que são baseados em BAPTA moléculas orgânicas que alterar as suas propriedades espectrais, em resposta à ligação de íons Ca2 +. Corantes indicador de cálcio caem em duas categorias, relação de métricas corantes como Fura-2 e Indo-1 e um único comprimento de onda corantes como Fluo-4. Relação de métricas corantes mudar tanto sua excitação ou seus espectros de emissão em resposta ao cálcio, permitindo a concentração de cálcio intracelular para ser determinada a partir da proporção de emissão de fluorescência ou excitação em comprimentos de onda distintos. A principal vantagem do uso de relação de métricas corantes mais sondas único comprimento de onda é que o sinal relação é independente da concentração de corante, a intensidade da iluminação, e comprimento do percurso óptico permitindo que a concentração de cálcio intracelular a ser determinada independentemente de esses artefatos. Um dos indicadores de cálcio mais comum é o Fura-2, que tem um pico de emissão em 505 nm e muda o seu pico de excitação de 340 nm até 380 nm, em resposta ao cálcio vinculativo. Aqui nós descrevemos o uso de Fura-2 para medir a elevação de cálcio intracelular em neurônios e outras células excitáveis.
Protocol
Discussion
Nesta apresentação nós passamos por todas as etapas para a realização de imagens de cálcio usando Fura-2 AM. Usamos neurônios corticais como um modelo, mas imagens de cálcio pode ser usado para medir a concentração de cálcio intracelular em tempo real em uma variedade de células. Ao fazer este procedimento é importante o uso de lamínulas de vidro em vez de plástico, uma vez que o plástico é muitas vezes fluorescentes em comprimentos de onda ultravioleta, o que torna difícil de imagem. Além disso, é importante para o reve…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | EM Science | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | SIGMA | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, . A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, . Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, . Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
