Imagen de calcio de las neuronas corticales con Fura-2 a.m.
Summary
Señales de calcio juegan un papel clave en muchos procesos celulares, incluyendo la expresión génica, la supervivencia y la diferenciación. Aquí se demuestra cómo realizar imágenes de calcio con Fura-2 AM. Imágenes de calcio es una herramienta valiosa para estudiar la regulación del calcio intracelular en tiempo real y su regulación de cascadas de señalización.
Abstract
Imágenes de calcio es una técnica común que es útil para medir las señales de calcio en las células cultivadas. Técnicas de imagen de calcio aprovechar de tintes indicadores de calcio, que son BAPTA basado en moléculas orgánicas que cambian sus propiedades espectrales en respuesta a la unión de los iones Ca2 +. Tintes de calcio indicador se dividen en dos categorías, métricas relación-a colorantes como la Fura-2 y el Indo-1 y de una sola longitud de onda de colorantes como la Fluo-4. Métricas relación de colorantes o bien cambiar su excitación o de sus espectros de emisión en respuesta al calcio, lo que permite la concentración de calcio intracelular que se determina a partir de la proporción de emisión de fluorescencia o de excitación a longitudes de onda distintas. La principal ventaja de utilizar métricas relación de tintes más sondas sola longitud de onda es que la señal de relación es independiente de la concentración de colorante, la intensidad de iluminación, y la longitud del camino óptico que permite la concentración de calcio intracelular que se determinará de manera independiente de estos artefactos. Uno de los indicadores de calcio más común es la Fura-2, que tiene un pico de emisión a 505 nm y los cambios de su nivel máximo de excitación de 340 nm a 380 nm en respuesta al calcio. A continuación se describe el uso de la Fura-2 para medir las elevaciones de calcio intracelular en las neuronas y otras células excitables.
Protocol
Discussion
En esta presentación, hemos pasado por todos los pasos para la realización de imágenes de calcio con Fura-2 AM. Hemos utilizado las neuronas corticales como modelo, pero las imágenes de calcio puede ser usado para medir el calcio intracelular en tiempo real en una variedad de células. Cuando se realiza este procedimiento, es importante utilizar cubreobjetos de vidrio en lugar de plástico, ya que el plástico es a menudo fluorescente en longitudes de onda ultravioleta, lo que hace difícil de imágenes. Además, es importante que antes…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | EM Science | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | SIGMA | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, . A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, . Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, . Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
