社区环境转录从海洋微生物基因表达分析
Summary
我们提出了一个方法生成环境的mRNA的cDNA。在一般情况下，总RNA是第一次从环境中收集，rRNA的选择性去除，mRNA的选择性扩增，并从丰富的mRNA池合成cDNA测序。使用标准的生物信息学技术确定基因表达，恢复序列，可以注明。
Abstract
类似于宏基因组学，环境转录（metatranscriptomics）检索和环境微生物组合没有先验知识的社会可能是哪些基因表达序列的mRNA。因此，它提供了最不偏不倚的角度，对社区的基因表达<em>原位</em>。环境转录协议在技术上是困难的，因为原核生物mRNA的普遍缺乏的poly（A）尾巴，使真核细胞的消息隔离相对简单<sup> 1</sup>因为相对较短的mRNA半衰期<sup> 2</sup>。此外，mRNA的是远远低于在总RNA提取的rRNAs丰富，因此rRNA的背景往往淹没mRNA的信号。但是，为克服这些困难，一些技术最近被开发出来。最近描述一个用于分析环境创建克隆库，采用随机引物进行反向转录和健全环境的mRNA转录的过程是成功的在两个不同的自然环境，但结果被用于启动cDNA合成的随机引物的选择偏颇<sup> 3</sup>。线性扩增的mRNA的进展，避免随机引物扩增步骤的需要，并作出有可能使用较少的起始原料，从而降低了样品的收集和处理时间，从而最大限度地减少RNA降解<sup> 4</sup>。<em在体外</em放大mRNA的转录方法涉及polyadenylating的mRNA，并纳入到3月末的成绩单T7启动子。扩增RNA（ARNA），然后可以被转换为双用随机六聚体的双链cDNA，并直接测序由焦磷酸测序<sup> 5</sup>。第一次使用这种方法的一个站ALOHA表明微生物群落的基因表达特征的效用<sup> 6</sup>。
Protocol
Discussion
基因表达的天然微生物群落的调查，近年来已成为共同探索微生物的生态作用和功能的一种手段。海洋微生物的检测，量化，并表征结合使用，可用于基因表达分析链接系统发育功能的天然微生物群落。为目标的功能基因表达的许多技术，依赖于特异性探针或基因的已知序列设计的引物。相比之下，环保转录可用于研究基因的表达没有施加的限制，现有的序列数据，并正在积极表达这些基因的偏?…
Acknowledgements
经费是由戈登和贝蒂摩尔基金会赠款和美国国家科学基金会的资助MCB – 0702125。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | QIAGEN | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega | A7280 |
References
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