Analysant l'expression de gènes à partir communautés microbiennes marines utilisant Transcriptomique environnement
Summary
Nous présentons une méthode pour générer des ADNc de l'ARNm de l'environnement. En général, l'ARN total est d'abord recueilli de l'environnement, l'ARNr est enlevé sélectivement, l'ARNm est sélectivement amplifié, et l'ADNc synthétisé à partir de la piscine ARNm enrichi est séquencé. Séquences récupérés peuvent être annotés en utilisant des techniques standard de la bioinformatique pour identifier les gènes exprimés.
Abstract
Analogue à la métagénomique, transcriptomique de l'environnement (metatranscriptomics) récupère et les séquences des ARNm de l'environnement à partir d'un assemblage de micro sans connaissance préalable de ce que les gènes de la communauté pourrait être exprimer. Ainsi, il offre la perspective la plus impartiale sur l'expression du gène de la Communauté<em> In situ</em>. L'environnement protocoles transcriptomique sont techniquement difficiles depuis ARNm procaryotes n'ont généralement pas la poly (A) qui font des queues de messages l'isolement eucaryotes relativement simple<sup> 1</sup> Et à cause de la demi-vie relativement courte des ARNm<sup> 2</sup>. En outre, les ARNm sont beaucoup moins abondantes que ARNr dans les extraits d'ARN total, donc un fond d'ARNr dépasse souvent les signaux d'ARNm. Cependant, des techniques pour surmonter certaines de ces difficultés ont été récemment développés. Une procédure d'analyse des transcriptomes de l'environnement en créant des bibliothèques de clones en utilisant des amorces aléatoires pour inverser-transcrire et amplifier les ARNm de l'environnement a récemment été décrit a été réussie dans deux différents milieux naturels, mais les résultats ont été biaisés par la sélection des amorces aléatoires utilisées pour initier la synthèse d'ADNc<sup> 3</sup>. Les progrès de l'amplification linéaire de l'ARNm de parer à la nécessité pour les amorces aléatoires dans l'étape d'amplification et permettent d'utiliser moins de matières de départ diminue la collecte et le temps de traitement des échantillons et minimisant ainsi la dégradation de l'ARN<sup> 4</sup>.<em> In vitro</emMéthodes de transcription> pour l'ARNm amplifiant impliquent polyadenylating l'ARNm et en incorporant un promoteur T7 sur l'extrémité 3 de la transcription. Amplifié ARN (ARNa) peuvent ensuite être convertis en ADNc double brin en utilisant des hexamères aléatoires et séquencé directement par pyroséquençage<sup> 5</sup>. Une première utilisation de cette méthode à la station ALOHA démontré son utilité pour la caractérisation de l'expression des gènes microbiens communauté<sup> 6</sup>.
Protocol
Discussion
L'enquête de l'expression génique par les communautés microbiennes naturelles est devenue courante ces dernières années comme un moyen d'explorer les rôles et les fonctions écologiques des micro-organismes. Utilisé en combinaison avec la détection, la quantification et la caractérisation des micro-organismes marins, des analyses d'expression génique peut être utilisé pour relier la phylogénie de fonctionner dans les communautés microbiennes naturelles. De nombreuses techniques pour cibler …
Acknowledgements
Le financement a été fourni par la Gordon and Betty Moore Foundation et subventions de la National Science Foundation accorde MCB-0702125.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PowerSoil Bead Tubes | kit | MoBio | 12866-25-PBT | |
| RNeasy Mini Kit | kit | QIAGEN | 74104 | |
| TURBO DNA-free | kit | Ambion | AM1907 | |
| mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit | kit | Epicentre | MOP51010/MOP51024 | |
| MICROBExpress Bacterial mRNA Enrichment Kit | kit | Ambion | AM1905 | |
| MICROBEnrich kit | kit | Ambion | AM1901 | |
| MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit | kit | Ambion | AM1790 | |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | kit | Promega | C4360 | |
| Wizard DNA Clean-Up System | kit | Promega | A7280 |
References
- Liang, P., Pardee, A. B. . Science. 257 (5072), 967-967 (1992).
- Belasco, J. G., Belasco, J. G., Brawerman, G. Control of messenger RNA stability. , 3-11 (1993).
- Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. . 71 (7), 4121-4121 (2005).
- Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. . Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).
- Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. . Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).
- Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. . Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).
- Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. . Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).
