تنقية والتخيل من الأنفلونزا من المجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسية
Summary
جينوم فيروس الأنفلونزا يتكون من ثمانية مجمعات منفصلة من الحمض النووي الريبي والبروتينات ، ووصف المجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسي (vRNPs). وتصف هذه الورقة تنقية التدرج الجلسرين والتصور انتقال المجهر الإلكتروني من vRNPs الأنفلونزا.
Abstract
الأنفلونزا A الجينوم الفيروسي يتكون من ثمانية وبالمعنى السلبي ، واحد الذين تقطعت بهم السبل جزيئات الحمض النووي الريبي ، ومعبأة بشكل فردي مع نسخ متعددة من الأنفلونزا من البروتين النووي (NP) في جزيئات ribonulceoprotein الفيروسي (vRNPs). يتم تضمين vRNPs الأنفلونزا داخل المغلف الفيروسية. أثناء دخول الخلية ، ومع ذلك ، يتم الافراج هذه المجمعات vRNP إلى السيتوبلازم ، حيث تمكنوا من الوصول إلى آليات النقل المضيف النووية. من أجل دراسة استيراد النووية vRNPs الأنفلونزا وتكرار للجينوم الإنفلونزا ، فإنه من المفيد للعمل مع vRNPs معزولة بحيث المكونات الأخرى للفيروس لا تتدخل في هذه العمليات. هنا ، نحن وصف الإجراء لتنقية هذه vRNPs من الأنفلونزا من الفيروس. الإجراء يبدأ اضطراب الأنفلونزا A الفيريون مع المنظفات من أجل الافراج عن مجمعات vRNP من الفيريون يلفها. ثم يتم فصل vRNPs من المكونات الأخرى للأنفلونزا الفيريون على التدرج الجلسرين متقطع 33-70 ٪ من سرعة الترسيب. ثم يتم تحليل هذه الكسور التي تم الحصول عليها من الجلسرين على التدرج عبر SDS – PAGE بعد التلوين باللون الأزرق Coomassie. ثم يتم تجميع الكسور التي تحتوي على NP الذروة معا وتتركز بواسطة الطرد المركزي. بعد الاعتقال ، ويتم التحقق من سلامة vRNPs التي تصور من vRNPs بواسطة المجهر الإلكتروني انتقال بعد تلطيخ السلبية. تنقية التدرج الجلسرين هو تعديل ذلك من Kemler<em> وآخرون.</em> (1994)<sup> 1</sup> ، وكان أداء سلبي من تلطيخ وو<em> وآخرون.</em> (2007).<sup> 2</sup
Protocol
Discussion
وتستند عملية تنقية vRNPs على الإجراء التي وصفها Kemler وآخرون (1994). 1 نحن وغيرنا قد استخدمت أيضا لعزل هذا البروتوكول vRNPs لدراسة استيراد النووية. 2،4،5
نوصي باستخدام ريبونوكلياز خالية من نصائح وأنابيب عند التعامل مع vRNPs لأ…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المؤسسة الكندية للابتكار (CFI) والمعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR) ، والعلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A | Charles River Laboratories | 490715 | ||
| Tris | Sigma | T1503 | ||
| MES | Sigma | M-8250 | ||
| Glycerol | Fisher | G33-1 | ||
| Octylglucoside | Sigma | O-8001 | ||
| Lysolecithin | Sigma | L-4129 | ||
| Dithiothreitol | Sigma | D-9779 | ||
| Coomassie brilliant blue G-250 | Kodak | 1367796 | ||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water | Invitrogen | 750024 | ||
| Uranyl Acetate | Ted Pella | 19481 | ||
| Ammonium Molybdate | Fisher | A-674 | ||
| Optima MAX-E Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 434491 | ||
| MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket | Beckman Coulter | 367280 | ||
| TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium | Beckman Coulter | 362046 | ||
| Eppendorf Thermomixer | Brinkman | 022670000 |
References
- Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins. Virology. 202, 1028-1033 (1994).
- Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes. J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).
- Gasteiger, E., Walker, J. M. . The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, . Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein. Virol J. 4, 49-49 (2007).
- Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes. Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).
