A型流感病毒的核蛋白复合物的分离纯化及可视化
Summary
A型流感病毒的基因组由8个独立的复合物，RNA和蛋白质，称为病毒核蛋白复合物（vRNPs）。本文介绍的甘油梯度纯化和透射电子显微镜A型流感vRNPs可视化。
Abstract
A型流感病毒的基因组由8负意义上说，单链RNA分子单独包装，与A型流感到的病毒ribonulceoprotein颗粒（vRNPs）核蛋白（NP）的多个副本。流感vRNPs封闭的病毒包膜内。然而，在进入细胞，这些vRNP复合物释放到细胞质，在那里他们获得主机核运输机械。为了研究核进口的流感vRNPs和流感基因组复制的，它与孤立的vRNPs工作，使病毒的其他组件不干扰这些进程是有益的。在这里，我们描述一个过程来净化这些vRNPs从A型流感病毒。程序启动以释放笼罩病毒粒子vRNP复合物，用清洁剂A型流感病毒粒子的干扰。 vRNPs是从A型流感病毒粒子在33-70％的速度沉淀间断甘油梯度的其他部分隔开。从甘油梯度获得的分数，然后通过SDS – PAGE电泳分析，考马斯亮蓝染色后。包含NP峰值分数，然后汇集在一起，并通过离心浓缩。浓度后，vRNPs的完整性是通过可视化的传输电子显微镜负染色后的vRNPs验证。甘油梯度纯化的修改，从Kemler<em>等。</em>（1994）<sup> 1</sup>和负染色进行吴<em>等。</em>（2007年）。<sup> 2</sup
Protocol
Discussion
vRNPs净化Kemler 等人 （1994年）所描述的程序的基础上，我们和其他人也用此协议隔离vRNPs，研究它们的核进口。2,4,5
我们建议使用无RNase的技巧和操纵vRNPs管时，因为病毒基因组RNA的组成，因此很容易降解的RNA的存在。此外，所有的缓冲区，应即核糖核酸免费的水。这里所描述的协议，是一种酸性提取（如中断缓冲区和甘油梯度的pH值是5.5）。同样，一个基本的?…
Acknowledgements
这项工作是由加拿大创新基金会（CFI），加拿大卫生研究所（CIHR）学院，以及自然科学与工程研究理事会（NSERC），加拿大的赠款支持。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A | Charles River Laboratories | 490715 | ||
| Tris | Sigma | T1503 | ||
| MES | Sigma | M-8250 | ||
| Glycerol | Fisher | G33-1 | ||
| Octylglucoside | Sigma | O-8001 | ||
| Lysolecithin | Sigma | L-4129 | ||
| Dithiothreitol | Sigma | D-9779 | ||
| Coomassie brilliant blue G-250 | Kodak | 1367796 | ||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water | Invitrogen | 750024 | ||
| Uranyl Acetate | Ted Pella | 19481 | ||
| Ammonium Molybdate | Fisher | A-674 | ||
| Optima MAX-E Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 434491 | ||
| MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket | Beckman Coulter | 367280 | ||
| TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium | Beckman Coulter | 362046 | ||
| Eppendorf Thermomixer | Brinkman | 022670000 |
References
- Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins. Virology. 202, 1028-1033 (1994).
- Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes. J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).
- Gasteiger, E., Walker, J. M. . The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, . Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein. Virol J. 4, 49-49 (2007).
- Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes. Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).
