Zuivering en Visualisatie van Influenza A Viral ribonucleoproteïne Complexen

Summary

Het genoom van het influenza A-virus bestaat uit acht afzonderlijke complexen van RNA en eiwitten, de zogenaamde virale ribonucleoproteïne complexen (vRNPs). Dit document beschrijft de glycerol gradiënt zuivering en transmissie elektronenmicroscopie visualisatie van influenza A vRNPs.

Abstract

Het influenza A-virale genoom bestaat uit acht negatieve zin, enkelstrengs RNA-moleculen, individueel verpakt met meerdere exemplaren van het influenza A nucleoproteïne (NP) in virale ribonulceoprotein deeltjes (vRNPs). De influenza vRNPs zijn ingesloten in de virale envelop. Tijdens de cel ingang, echter zijn deze vRNP complexen vrijkomen in het cytoplasma, waar ze toegang krijgen tot de host nucleair transport machines. Met het oog op studie van de nucleaire import van influenza vRNPs en de replicatie van het influenza genoom, is het nuttig om te werken met geïsoleerde vRNPs zodat andere onderdelen van het virus niet interfereren met deze processen. We beschrijven hier een procedure om deze vRNPs zuiveren van het influenza A-virus. De procedure begint met de verstoring van het influenza A-virion met detergenten om de vRNP complexen uit de envelop virion release. De vRNPs worden dan gescheiden van de andere componenten van het influenza-A-virion op een 33-70% glycerol discontinue gradiënt door snelheid sedimentatie. De fracties verkregen uit de glycerol gradiënt worden vervolgens geanalyseerd op via SDS-PAGE na kleuring met Coomassie blauw. De piek fracties die NP worden vervolgens gebundeld en geconcentreerd door centrifugeren. Na concentratie, is de integriteit van de vRNPs gecontroleerd door visualisatie van de vRNPs door transmissie elektronenmicroscopie na negatieve kleuring. De glycerol gradiënt zuivering is een wijziging van die van Kemler<em> Et al..</em> (1994)¹, En de negatieve kleuring is uitgevoerd door Wu<em> Et al..</em> (2007).<sup> 2</sup

Protocol

Deel 1: Verstoring van het Influenza A Virion Voeg 750 ul van de MNT-buffer (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) in een Beckman polycarbonaat centrifugebuis (11 mm x 34 mm), ontworpen om in een TLA-120.2 rotor geschikt voor gebruik in een Beekman Optima Max-E ultracentrifuge. Voeg 500 ul van het influenza A virus (H3N2 X-31 A/AICHI/68 stam, 2 mg / ml) in die buis. Meng het virus met de MNT buffer door en neer te pipetteren meerdere malen. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 109.0…

Discussion

De zuivering van vRNPs is gebaseerd op de procedure beschreven door Kemler et al.. (1994). ¹ Wij en anderen hebben ook gebruikt dit protocol om vRNPs isoleren om hun nucleaire import te bestuderen. ^2,4,5

Wij raden het gebruik van RNase-gratis tips en buizen voor het manipuleren van vRNPs omdat het virale genoom bestaat uit RNA, en dus breekt gemakkelijk in de aanwezigheid van RNA. Daarnaast moeten alle buffers worden gemaakt in water dat is RNase vrij. Het prot…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A		Charles River Laboratories	490715
Tris		Sigma	T1503
MES		Sigma	M-8250
Glycerol		Fisher	G33-1
Octylglucoside		Sigma	O-8001
Lysolecithin		Sigma	L-4129
Dithiothreitol		Sigma	D-9779
Coomassie brilliant blue G-250		Kodak	1367796
diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water		Invitrogen	750024
Uranyl Acetate		Ted Pella	19481
Ammonium Molybdate		Fisher	A-674
Optima MAX-E Ultracentrifuge		Beckman Coulter	434491
MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket		Beckman Coulter	367280
TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium		Beckman Coulter	362046
Eppendorf Thermomixer		Brinkman	022670000