טיהור ויזואליזציה של שפעת מכלולים Ribonucleoprotein ויראלי
Summary
הגנום של שפעת וירוס כוללת שמונה מתחמים נפרדים של רנ"א וחלבונים, כינה מתחמי ribonucleoprotein ויראלי (vRNPs). מאמר זה מתאר את שיפוע גליצרול טיהור במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים להדמיה של שפעת vRNPs.
Abstract
שפעת A הגנום הנגיפי מורכב תחושה שלילית ושמונה, יחיד מולקולות RNA תקועים, ארוזים בנפרד עם מספר עותקים של שפעת nucleoprotein (NP) לחלקיקים ribonulceoprotein ויראלי (vRNPs). VRNPs שפעת מוקפים בתוך מעטפת נגיפיים. במהלך כניסה לתא, לעומת זאת, קומפלקסים אלה vRNP משתחררים לתוך הציטופלסמה, שם הם לקבל גישה מכונות התחבורה גרעיני המארח. על מנת ללמוד את הייבוא הגרעין של vRNPs שפעת שכפול של הגנום שפעת, כדאי לעבוד עם vRNPs מבודד כך רכיבים אחרים של הנגיף לא להפריע לתהליכים אלה. כאן אנו מתארים הליך לטהר אלה vRNPs משפעת וירוס. ההליך מתחיל עם הפרעה של שפעת virion עם דטרגנטים על מנת לשחרר את מתחמי vRNP מ virion אפף. VRNPs מופרדים אז מן המרכיבים האחרים של שפעת virion על שיפוע 33-70% גליצרול רציפה על ידי שקיעה מהירות. שברים המתקבל השיפוע גליצרול מנותחים לאחר מכן צביעה עם Coomassie כחול על דרך עמוד SDS. שברים השיא המכיל NP אז הם אספו יחד מרוכז על ידי צנטריפוגה. לאחר ריכוז, שלמות vRNPs הוא מאומת על ידי הדמיה של vRNPs ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים לאחר מכתים שלילי. טיהור הדרגתי גליצרול הוא שינוי כי מן קמלר<em> Et al.</em> (1994)<sup> 1</sup> ו מכתים השלילי שבוצעה על ידי וו<em> Et al.</em> (2007).<sup> 2</sup
Protocol
Discussion
טיהור vRNPs מבוסס על ההליך המתואר על ידי קמלר et al. (1994). 1 אנו ואחרים משמשים גם בפרוטוקול זה על מנת לבודד vRNPs ללמוד לייבא הגרעין שלהם. 2,4,5
אנו ממליצים להשתמש RNase ללא טיפים וצינורות כאשר מניפולציה vRNPs כי הגנום הנגיפי מורכ?…
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן קנדה עבור חדשנות (CFI), המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR), ואת למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A | Charles River Laboratories | 490715 | ||
| Tris | Sigma | T1503 | ||
| MES | Sigma | M-8250 | ||
| Glycerol | Fisher | G33-1 | ||
| Octylglucoside | Sigma | O-8001 | ||
| Lysolecithin | Sigma | L-4129 | ||
| Dithiothreitol | Sigma | D-9779 | ||
| Coomassie brilliant blue G-250 | Kodak | 1367796 | ||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water | Invitrogen | 750024 | ||
| Uranyl Acetate | Ted Pella | 19481 | ||
| Ammonium Molybdate | Fisher | A-674 | ||
| Optima MAX-E Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 434491 | ||
| MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket | Beckman Coulter | 367280 | ||
| TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium | Beckman Coulter | 362046 | ||
| Eppendorf Thermomixer | Brinkman | 022670000 |
References
- Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins. Virology. 202, 1028-1033 (1994).
- Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes. J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).
- Gasteiger, E., Walker, J. M. . The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, . Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein. Virol J. 4, 49-49 (2007).
- Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes. Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).
