और इन्फ्लूएंजा वायरल Ribonucleoprotein परिसर के शोधन विज़ुअलाइज़ेशन
Summary
इन्फ्लूएंजा ए वायरस के जीनोम आरएनए और प्रोटीन के आठ अलग – अलग परिसरों, करार दिया वायरल ribonucleoprotein परिसरों (vRNPs) के होते हैं. इस कागज ग्लिसरॉल ढाल शुद्धि और इन्फ्लूएंजा vRNPs के संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी दृश्य का वर्णन करता है.
Abstract
इन्फ्लूएंजा एक वायरल जीनोम आठ भावना नकारात्मक, एकल असहाय शाही सेना अणु, व्यक्तिगत nucleoprotein वायरल ribonulceoprotein कण (vRNPs) में इन्फ्लूएंजा (NP) के एकाधिक प्रतियों के साथ पैक के होते हैं. इन्फ्लूएंजा vRNPs वायरल लिफाफे के भीतर संलग्न हैं. सेल प्रविष्टि के दौरान, तथापि, इन vRNP परिसरों cytoplasm में जारी कर रहे हैं, जहां वे मेजबान परमाणु परिवहन मशीनरी के लिए पहुँच प्राप्त है. आदेश में इन्फ्लूएंजा vRNPs और इन्फ्लूएंजा जीनोम की प्रतिकृति के परमाणु आयात अध्ययन करने के लिए, यह उपयोगी है पृथक vRNPs के साथ काम इतना है कि वायरस के अन्य घटकों इन प्रक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप नहीं करते. यहाँ, हम एक इन्फ्लूएंजा ए वायरस से इन vRNPs शुद्ध प्रक्रिया का वर्णन करता है. प्रक्रिया डिटर्जेंट के साथ एक virion इन्फ्लूएंजा के विघटन के साथ शुरू होता है क्रम में छा virion से vRNP परिसरों जारी है. vRNPs तो 33-70% वेग अवसादन के द्वारा असंतत ग्लिसरॉल ढाल पर एक virion इन्फ्लूएंजा के अन्य घटकों से अलग हो रहे हैं. ग्लिसरॉल ढाल से प्राप्त भिन्न तो Coomassie नीले के साथ धुंधला के बाद एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से विश्लेषण कर रहे हैं. पीक एनपी युक्त भिन्न तो एक साथ जमा कर रहे हैं और centrifugation द्वारा केंद्रित. एकाग्रता के बाद, vRNPs की अखंडता नकारात्मक धुंधला के बाद संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा vRNPs दृश्य द्वारा सत्यापित है. ग्लिसरॉल ढाल शुद्धि Kemler से है कि एक संशोधन है<em> एट अल.</em> (1994)<sup> 1</sup> और नकारात्मक धुंधला वू द्वारा किया गया प्रदर्शन किया है<em> एट अल.</em> (2007).<sup2></sup
Protocol
Discussion
vRNPs की शुद्धि Kemler एट अल (1994) द्वारा वर्णित की प्रक्रिया पर आधारित है 1 हम और दूसरों को भी इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है vRNPs को अलग करने के लिए अपने परमाणु आयात अध्ययन. 2,4,5
हम RNase मुफ्त सुझ?…
Acknowledgements
इस काम अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन (CFI), स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) के कनाडा संस्थान, और प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल () NSERC से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A | Charles River Laboratories | 490715 | ||
| Tris | Sigma | T1503 | ||
| MES | Sigma | M-8250 | ||
| Glycerol | Fisher | G33-1 | ||
| Octylglucoside | Sigma | O-8001 | ||
| Lysolecithin | Sigma | L-4129 | ||
| Dithiothreitol | Sigma | D-9779 | ||
| Coomassie brilliant blue G-250 | Kodak | 1367796 | ||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water | Invitrogen | 750024 | ||
| Uranyl Acetate | Ted Pella | 19481 | ||
| Ammonium Molybdate | Fisher | A-674 | ||
| Optima MAX-E Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 434491 | ||
| MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket | Beckman Coulter | 367280 | ||
| TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium | Beckman Coulter | 362046 | ||
| Eppendorf Thermomixer | Brinkman | 022670000 |
References
- Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins. Virology. 202, 1028-1033 (1994).
- Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes. J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).
- Gasteiger, E., Walker, J. M. . The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, . Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein. Virol J. 4, 49-49 (2007).
- Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes. Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).
