インフルエンザウイルスリボ核タンパク質複合体の精製と可視化
Summary
インフルエンザウイルスのゲノムは、RNAとタンパク質の8つの独立した複合体と呼ばれる、ウイルスのリボ核タンパク質複合体（vRNPs）で構成されています。本論文では、グリセロール勾配精製とインフルエンザvRNPsの透過型電子顕微鏡の可視化について説明します。
Abstract
インフルエンザウイルスゲノムは8つの負のセンス、個々にインフルエンザの複数のコピーウイルスribonulceoprotein粒子（vRNPs）に核蛋白（NP）が充填された一本鎖RNA分子で構成されています。インフルエンザvRNPsは、ウイルスエンベロープで囲まれています。セルの入力時に、しかし、これらのvRNP複合体は、それらが宿主核輸送機構へのアクセスを細胞質に放出されています。インフルエンザvRNPsとインフルエンザのゲノムの複製の核移入を研究するために、それはウイルスの他のコンポーネントがこれらのプロセスに干渉しないように隔離されたvRNPsで作業するのに便利です。ここで、我々は、インフルエンザウイルスからこれらvRNPsを精製する手順を説明します。手順は、包まれたビリオンからvRNP複合体を解放するために、インフルエンザの混乱洗剤とビリオンから始まります。 vRNPsは、インフルエンザ速度沈降によって33から70パーセント不連続グリセロール勾配でビリオンの他のコンポーネントから分離されています。グリセロール勾配から得られた分画は、クマシーブルーで染色後を経由してSDS – PAGEで分析されています。 NPを含有するピーク画分を一緒にプールし、遠心分離により濃縮されています。濃縮後、vRNPsの整合性は、ネガティブ染色した後、透過型電子顕微鏡によるvRNPsの可視化によって検証されます。グリセロール密度勾配による精製はKemlerからその修正したものです<em>ら。</em>（1994）<sup> 1</sup>、および負の染色が呉で行われている<em>ら。</em>（2007）。<sup> 2</sup
Protocol
Discussion
vRNPsの精製がKemler ら （1994）によって記載された手順に基づいている。1私達と他の人も自分の核移入を勉強するvRNPsを分離するためにこのプロトコルを使用している。2,4,5
我々は、ウイルスゲノムはRNAで構成されているためRNaseフリーヒントやvRNPsを操作するチューブの使用をお勧めします、そのためRNAの存在下で容易に分解する。さらに、すべて?…
Acknowledgements
この作品は、イノベーションのためのカナダ基金（CFI）、健康研究（CIHR）のカナダの研究所、およびカナダ自然科学工学研究評議会（NSERC）からの補助金によって支えられている。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A | Charles River Laboratories | 490715 | ||
| Tris | Sigma | T1503 | ||
| MES | Sigma | M-8250 | ||
| Glycerol | Fisher | G33-1 | ||
| Octylglucoside | Sigma | O-8001 | ||
| Lysolecithin | Sigma | L-4129 | ||
| Dithiothreitol | Sigma | D-9779 | ||
| Coomassie brilliant blue G-250 | Kodak | 1367796 | ||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water | Invitrogen | 750024 | ||
| Uranyl Acetate | Ted Pella | 19481 | ||
| Ammonium Molybdate | Fisher | A-674 | ||
| Optima MAX-E Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 434491 | ||
| MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket | Beckman Coulter | 367280 | ||
| TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium | Beckman Coulter | 362046 | ||
| Eppendorf Thermomixer | Brinkman | 022670000 |
References
- Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins. Virology. 202, 1028-1033 (1994).
- Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes. J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).
- Gasteiger, E., Walker, J. M. . The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, . Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein. Virol J. 4, 49-49 (2007).
- Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes. Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).
