Очистка и визуализация гриппа Вирусный комплексы рибонуклеопротеидных
Summary
Геном вируса гриппа А состоит из восьми отдельных комплексов РНК и белков, называемых вирусными комплексов рибонуклеопротеидных (vRNPs). Эта статья описывает очистки глицерина градиента и просвечивающей электронной микроскопии визуализации гриппа vRNPs.
Abstract
Гриппа, вирусного генома состоит из восьми отрицательного смысла, одноцепочечной молекулы РНК, в индивидуальной упаковке с несколькими копиями гриппа нуклеопротеида (НП) в вирусные частицы ribonulceoprotein (vRNPs). Гриппа vRNPs заключены внутри вирусной оболочки. Во время ввода данных в ячейку, однако, эти vRNP комплексов высвобождаются в цитоплазму, где они получают доступ к хост ядерное движение машин. С целью изучения ядерного импорта гриппа vRNPs и репликации генома гриппа, это полезно для работы с изолированными vRNPs так, чтобы другие компоненты вируса не вмешиваются в эти процессы. Здесь мы опишем процедуру, чтобы очистить эти vRNPs от гриппа вирус. Процедура начинается с нарушения гриппа вириона с моющими средствами для того, чтобы выпустить vRNP комплексов из окутан вириона. VRNPs затем отделить от других компонентов вириона гриппа на 33-70% разрывной градиент глицерина по скорости осадконакопления. Фракции, полученные из глицерина градиент которые затем анализируются с помощью на SDS-PAGE после окрашивания Кумасси синий. Пик фракций, содержащих НП затем объединяются и концентрированной с помощью центрифугирования. После концентрации, целостность vRNPs проверяется визуализации vRNPs методом просвечивающей электронной микроскопии после отрицательного окрашивания. Очистки глицерина градиент изменения, что с Кемлера<em> Соавт.</em> (1994)<sup> 1</sup>, И отрицательные окрашивания был выполнен Ву<em> Соавт.</em> (2007).<sup> 2</sup
Protocol
Discussion
Очистка vRNPs основана на методике, описанной Кемлера и соавт. (1994) 1. Мы и другие также используют этот протокол для изоляции vRNPs для изучения их ядерных импорта. 2,4,5
Мы рекомендуем использовать РНКазы-бесплатные советы и трубки при манипулировании vRNPs потом…
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Канады Фонд инноваций (CFI), Канадский институт исследований в области здравоохранения (CIHR), и естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады (NSERC).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A | Charles River Laboratories | 490715 | ||
| Tris | Sigma | T1503 | ||
| MES | Sigma | M-8250 | ||
| Glycerol | Fisher | G33-1 | ||
| Octylglucoside | Sigma | O-8001 | ||
| Lysolecithin | Sigma | L-4129 | ||
| Dithiothreitol | Sigma | D-9779 | ||
| Coomassie brilliant blue G-250 | Kodak | 1367796 | ||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water | Invitrogen | 750024 | ||
| Uranyl Acetate | Ted Pella | 19481 | ||
| Ammonium Molybdate | Fisher | A-674 | ||
| Optima MAX-E Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 434491 | ||
| MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket | Beckman Coulter | 367280 | ||
| TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium | Beckman Coulter | 362046 | ||
| Eppendorf Thermomixer | Brinkman | 022670000 |
References
- Kemler, I., Whittaker, G., Helenius, A. Nuclear import of microinjected influenza virus ribonucleoproteins. Virology. 202, 1028-1033 (1994).
- Wu, W. W. H., Weaver, L. L., Panté, N. Ultrastructural analysis of the nuclear localization sequences on influenza a ribonucleoprotein complexes. J Mol Biol. 374, 910-916 (2007).
- Gasteiger, E., Walker, J. M. . The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Wu, W. W. H., Sun, Y. H. B., Panté, . Nuclear import of influenza A viral ribonucleoprotein complexes is mediated by two nuclear localization sequences on viral nucleoprotein. Virol J. 4, 49-49 (2007).
- Babcock, H. P., Chen, C., Zhuang, X. Using single-particle tracking to study nuclear trafficking of viral genes. Biophys J. 87, 2749-2758 (2004).
