Rening och visualisering av influensa A Viral Ribonucleoprotein Complexes

Summary

Genomet av influensa A-virus består av åtta separata komplex av RNA och proteiner, kallade virala ribonucleoprotein komplex (vRNPs). Detta dokument beskriver rening glycerol lutning och transmissionselektronmikroskopi visualisering av influensa A vRNPs.

Abstract

Influensa A virala genomet består av åtta negativ bemärkelse, enda RNA-molekyler, individuellt packad med flera kopior av influensa A nukleoprotein (NP) i virus ribonulceoprotein partiklar (vRNPs). Den influensa vRNPs är innesluten i den virala kuvertet. Under cellinmatning, dock dessa vRNP komplex släppas ut i cytoplasman, där de får tillgång till värden kärntransport maskiner. För att studera det nukleära import av influensa vRNPs och replikation av influensavirus genomet, är det bra att arbeta med isolerade vRNPs så att andra delar av viruset inte stör dessa processer. Här beskriver vi en procedur för att rena dessa vRNPs från influensa A-virus. Förfarandet inleds med störningar av influensa A-virus med tvättmedel för att lossa vRNP komplex från insvept virionens. Den vRNPs separeras sedan från andra delar av influensa A virus på en 33-70% diskontinuerlig glycerol lutning av hastighet sedimentering. De procenttal som erhålls från glycerol gradienten analyseras sedan på via SDS-PAGE efter färgning med Coomassie blå. Den högsta fraktioner som innehåller nonylfenol sedan sammanförs och koncentreras genom centrifugering. Efter koncentrationen är integritet vRNPs kontrolleras av visualisering av vRNPs genom transmissionselektronmikroskop efter negativa färgning. Den glycerol lutning reningen är en modifiering av det från Kemler<em> Et al.</em> (1994)¹, Och negativ färgning har utförts av Wu<em> Et al.</em> (2007).<sup> 2</sup

Protocol

Del 1: Rubbning av influensa A Virion Tillsätt 750 ìl MNT buffert (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) till en Beckman polykarbonat centrifugrör (11 mm x 34 mm) utformad för att passa in i en TLA-120,2 rotor för användning i en Beckman Optima Max-E ultracentrifugen. Tillsätt 500 ìl av influensa A-virus (H3N2 X-31 A/AICHI/68 stam, 2 mg / ml) in i det röret. Blanda viruset med MNT buffert genom att pipettera upp och ned flera gånger. Centrifugera i 10 minuter vid 109.000 xg…

Discussion

Rening av vRNPs bygger på den som beskrivs Kemler et al. (1994). ¹ Vi och andra har också använt detta protokoll för att isolera vRNPs att studera deras nukleära import. ^2,4,5

Vi rekommenderar användning av RNase-fria tips och tuber när manipulera vRNPs eftersom det virala genomet består av RNA, och därför bryter lätt i närvaro av RNA. Dessutom bör alla buffertar ske i vatten som är RNas gratis. Protokollet som beskrivs här genomfördes med en su…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A		Charles River Laboratories	490715
Tris		Sigma	T1503
MES		Sigma	M-8250
Glycerol		Fisher	G33-1
Octylglucoside		Sigma	O-8001
Lysolecithin		Sigma	L-4129
Dithiothreitol		Sigma	D-9779
Coomassie brilliant blue G-250		Kodak	1367796
diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water		Invitrogen	750024
Uranyl Acetate		Ted Pella	19481
Ammonium Molybdate		Fisher	A-674
Optima MAX-E Ultracentrifuge		Beckman Coulter	434491
MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket		Beckman Coulter	367280
TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium		Beckman Coulter	362046
Eppendorf Thermomixer		Brinkman	022670000