Mikroinjektion av Xenopus laevis oocyter
Summary
Här visar vi cytoplasmiska mikroinjektion av<em> Xenopus laevis</em> Oocyter med en nukleär import substrat, samt utarbetande av den injicerade ägg för visualisering genom tunn-sektionering elektronmikroskopi.
Abstract
Mikroinjektion av Xenopus laevis oocyter följt av tunna sektionering elektronmikroskopi (EM) är ett utmärkt system för att studera nucleocytoplasmic transporter. På grund av dess stora kärnan och hög täthet av nukleära porer komplex (NPC), kan kärntransport enkelt visualiseras i Xenopus äggcellen. Mycket insikt i de mekanismer av kärnvapen import och export har fått genom att använda detta system (granskats av Pante, 2006). Dessutom har vi använt mikroinjektion av Xenopus äggceller att dissekera den nukleära import vägar av flera virus som replikerar i den mottagande kärnan.
Här kan vi visa cytoplasmiska mikroinjektion av Xenopus oocyter med en nukleär import substrat. Vi visar också beredningen av det injicerade ägg för visualisering genom tunn-sektionering EM, inklusive dissektion, uttorkning, och inbäddning av oocyter i en epoxi bädda harts. Slutligen ger vi representativa resultat för ägg som har idag injiceras med kapsid av baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) eller parvovirus minuten virus Möss (MVM), och diskutera möjliga tillämpningar av tekniken.
Protocol
Discussion
Mikroinjektion av Xenopus oocyter i kombination med tunna sektionering EM är ett mycket effektivt verktyg för att studera nucleocytoplasmic transporter. Detta system har använts för att kartlägga olika steg av import via NPC, till exempel samspelet mellan en nukleär import substrat med strukturella komponenter i den nationella folkkongressen, såsom cytoplasmiska filament och kärnkraft korg (granskats av Pante, 2006). Det har också använts för att studera det nukleära import av kärnvapen replikera v…
Acknowledgements
Vi tackar David Theilmann (Pacific Agri-Food Research Centre, Summerland, British Columbia) för att tillhandahålla baculovirus AcMNPV och hjälpsamma diskussion.
Detta arbete har finansierats med bidrag från Kanada Foundation for Innovation (CFI), den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR), den Michael Smith Stiftelsen för hälsoforskning (MSFHR) och naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC) .
References
- Panté, N. Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies. Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).
- Panté, N., Kann, M. Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm. Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).
- Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).
- Cohen, S., Panté, N. Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope. J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).
- Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy. RNA. 3, 498-513 (1997).
