Raccolta e Crioconservazione degli ovociti e di embrioni di topo criceto
Summary
In questo video-articolo vi presentiamo un passo-passo dimostrazione su come raccogliere e crioconservare gli ovociti di criceto con elevate post-disgelo tassi di sopravvivenza. La stessa procedura può anche essere applicato con successo per congelare e scongelare embrioni di topo a diversi stadi di sviluppo preimpianto.
Abstract
Embrioni e ovociti crioconservati con successo sono stati più di 30 anni fa, quando Whittingham<i> Et al.</i><sup> 1</sup> E Wilmut<sup> 2</sup> Separatamente descritto embrioni di topo che potrebbero essere congelati e conservati a -196 ° C e, pochi anni dopo, Parkening<i> Et al</i>.<sup> 3</sup> Segnalato la nascita di piccoli vivi da fecondazione in vitro (IVF) di ovociti crioconservati. Da allora, l'uso di tecniche di crioconservazione è rapidamente diffusa a diventare una componente essenziale nella pratica della umana e animale riproduzione assistita e nella conservazione delle risorse genetiche animali. Attualmente, ci sono due metodi principali utilizzati per crioconservare gli ovociti e gli embrioni: il congelamento lento e vitrificazione. Una vasta gamma di approcci sono stati utilizzati per cercare di migliorare sia le tecniche e milioni di animali e migliaia di bambini sono nati da embrioni crioconservati. Tuttavia, le carenze importanti associati alla crioconservazione devono ancora essere superate, in quanto formazione di cristalli di ghiaccio, effetti soluzione e shock osmotico sembrano causare cryoinjuries diversi post-scongelamento degli ovociti e degli embrioni. Congelamento lento con congelatori programmabili ha il vantaggio di usare basse concentrazioni di crioprotettori, che sono di solito associati a tossicità chimica e shock osmotico, ma la loro capacità di evitare la formazione di cristalli di ghiaccio a basse concentrazioni è limitata. Congelamento lento induce anche gli effetti surraffreddamento che deve essere evitato di usare la semina manuale o automatico<sup> 4</sup>. Nel processo di vetrificazione, alte concentrazioni di crioprotettori inibire la formazione di cristalli di ghiaccio e portare alla formazione di uno stato simile a vetro ceramico in cui è solidificato acqua, ma non ampliato. Tuttavia, a causa della tossicità del cyroprotectants alle concentrazioni utilizzate, gli ovociti / embrioni non può che essere esposti alla soluzione crioprotettore per un periodo di tempo molto breve e in una soluzione di volume minimo, prima sommergendo i campioni direttamente in azoto liquido<sup> 5</sup>. Negli ultimi dieci anni, vetrificazione è diventato più popolare perché è un metodo molto veloce in cui è richiesta nessuna attrezzatura costosa (congelatore programmabile). Tuttavia, il congelamento lento continua ad essere il metodo più utilizzato per ovocita / embrione crioconservazione. In questo video-articolo mostriamo, passo per passo, come raccogliere e lentamente congelare ovociti di criceto con elevate post-disgelo tassi di sopravvivenza. La stessa procedura può anche essere applicato con successo per congelare e scongelare embrioni di topo a diversi stadi di sviluppo preimpianto.
Protocol
Discussion
Con questo protocollo e ovociti di criceto embrioni di topo possono essere crioconservati con successo. Una volta congelati, gli ovociti / embrioni possono essere conservati in serbatoi di azoto liquido a tempo indeterminato e recuperato in qualsiasi momento o luogo desiderato. Questo offre il vantaggio di avere campioni quasi pronto per l'uso in caso di necessità. D'altra parte, questo protocollo può essere utilizzato anche per generare criobanche embrione di ceppi di topi di valore (come linee transgeniche), come alternativa eco…
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministerio de Educación y spagnolo Ciencia (BIO 2006-11792) e la Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Gli autori ringraziano Marc Puigcerver e Jonatan Lucas per la loro assistenza tecnica per la preparazione dei mezzi. Tutto il personale da d'Servei Estabulari è riconosciuto per la stabulazione degli animali, e soprattutto Juan Jose Martin e Javier Benito per il loro contributo supplementare a registrare parte di questo video. BCN è un collega del portoghese Fundação para a Ciência e Tecnologia e SG è un compagno dello spagnolo Ministerio de Educación y Ciencia.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U. Cryobiological principles of embryo freezing. J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).
- Vajta, G., Kuwayama, M. Improving cryopreservation systems. Theriogenology. 65, 236-244 (2006).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. JoVE. 3, (2007).
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
