수집 및 햄스터 Oocytes 및 마우스 태아의 Cryopreservation
Summary
이 동영상 기사에서 우리는 하이 포스트 – 해동 서바이벌 속도로 햄스터 oocytes를 수집하고 cryopreserve하는 방법에 대한 단계별 데모를 제시한다. 동일한 절차도 성공적으로 동결과 preimplantation 개발의 다른 단계에 마우스 배아를 해동 적용할 수 있습니다.
Abstract
언제 위팅엄 배아와 oocytes 처음으로 성공적으로 30여 년 전에 cryopreserved되었습니다<i> 외.</i><sup> 1</sup> 그리고 Wilmut<sup> 2</sup> 별도 Parkening, 마우스 배아는 ° C, 그리고 몇 년 후 -196에서 냉동 및 보관 수 있다고 설명<i> 외</i>.<sup> 3</sup>는 cryopreserved oocytes의 체외의 수정 (IVF)에 인한 사는 자식의 탄생을 보도했다. 이후, cryopreservation 기술의 사용이 급속도로 인간과 동물의 지원 복제의 관행과 동물 유전 자원 보존에 필수적인 요소가 될 확산되었습니다. 느린 동결 vitrification : 현재 oocytes과 배아를 cryopreserve하는 데 사용되는 두 가지 방법이 있습니다. 접근 방식의 다양한는 동물과 수천명의 아이들이 모두 기술과 수백만을 향상시키기 위해 노력하는 데 사용되었습니다 것은 cryopreserved 배아에서 태어난되었습니다. 그러나, cryopreservation 관련된 중요한 단점은 아직 얼음 결정 형성이 솔루션 효과 및 삼투 충격 게시 – 해동 oocytes과 배아 여러 cryoinjuries을 일으킬 것 때문에, 극복해야합니다. 프로그램 냉동고와 느린 냉동은 일반적으로 화학적 독성과 삼투 충격와 관련된 cryoprotectants의 낮은 농도를 사용하는 장점을 가지고 있지만, 낮은 농도에서 얼음 결정 형성을 피하기 위해 자신의 능력이 제한됩니다. 느린 냉동은 또한 수동 또는 자동 시딩를 사용하여 피할 수 있어야합니다 supercooling 효과를 유도<sup> 4</sup>. vitrification 과정에서, cryoprotectants 높은 농도는 아이스 결정의 형성을 억제하고 물을 확정되는 glasslike vitrified 국가의 형성으로 이어질하지만, 확장되지 않습니다. 그러나, 때문에 사용 농도에 cyroprotectants의 독성에, oocytes / 배아는 액체 질소에 직접 샘플을 잠수함이 잠수하기 전에, 시간의 아주 짧은 기간과 최소 볼륨 솔루션 cryoprotectant 솔루션에 노출 수 있습니다<sup> 5</sup>. 그것도 고가의 장비 (프로그램 냉동고)가 필요하지 않습니다있는 매우 빠른 방법입니다 때문에 지난 10 년, vitrification 더 인기를 끌고있다. 그러나, 느린 냉동은 oocyte / 배아 cryopreservation에 가장 널리 사용되는 방법으로하고 있습니다. 이 동영상 기사에서 우리는 하이 포스트 – 해동 서바이벌 속도로 햄스터 oocytes를 수집하고 천천히 동결하는 방법을 단계별로, 보여줍니다. 동일한 절차도 성공적으로 동결과 preimplantation 개발의 다른 단계에 마우스 배아를 해동 적용할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
이 프로토콜의 햄스터 oocytes와 마우스 배아가 성공적으로 cryopreserved 수로. 일단 냉동, oocytes / 배아가 무한정 액체 질소 탱크에 저장하고 원하는 어떤 시간이나 장소에서 복구할 수 있습니다. 이것은 필요한 때마다 사용하는 샘플을 거의 준비가 갖는 장점을 제공합니다. 한편,이 프로토콜은 또한 라이브 동물 식민지의 유지 관리를 위해 경제적이고 안전한 대안으로 가치 마우스 종자 (예 : 유전자 변형 라인 등)에?…
Acknowledgements
이 작품은 스페인 정부의 드 Educación Y Ciencia (BIO 2006-11792)와 Generalitat 드 Catalunya (2005 – SGR00437)에 의해 지원되었다. 저자는 미디어를 준비하는 그들의 기술 지원을 마크 Puigcerver 및 Jonatan 루카스에게 감사를 표합니다. Servei D' Estabulari의 모든 직원은 동물의 주택에 대한 인정, 그리고이 비디오의 일부를 녹화에서 자신의 추가적인 기여 특히 후안 호세 마틴과 하비에르 베니토입니다. NCB가 Ciência E Tecnologia과 SG는 스페인 정부의 드 Educación Y Ciencia의 동료입니다 포르투갈어 Fundação 파라의 동료입니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
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