Insamling och Frysförvaring av Hamster äggceller och embryon Mus
Summary
I denna video-artikeln presenterar vi en steg-för-steg demonstration om hur man samlar och cryopreserve hamster oocyter med hög post-tina överlevnad. Samma förfarande kan också tillämpas för att lyckas frysa och tina musembryon i olika skeden av preimplantatorisk utveckling.
Abstract
Embryon och ägg var först framgångsrikt frysförvarade mer än 30 år sedan, när Whittingham<i> Et al.</i><sup> 1</sup> Och Wilmut<sup> 2</sup> Separat beskrivs som musembryon kan frysas och förvaras vid -196 ° C och, några år senare, Parkening<i> Et al</i>.<sup> 3</sup> Rapporterade födelse av levande avkomma till följd av in vitro-fertilisering (IVF) i frysförvarade oocyter. Sedan dess har användningen av frysförvaring metoder spred sig snabbt till att bli en viktig komponent i praktiken hos människor och djur assisterad befruktning och vid bevarande av animaliska genetiska resurser. För närvarande finns det två huvudsakliga metoder för att cryopreserve oocyter och embryon: långsam frysning och förglasning. En rad olika metoder har använts för att försöka förbättra både tekniker och miljontals djur och tusentals barn har fötts ur frysförvarade embryon. Stora brister finns dock associerade till frysförvaring återstår att övervinna, eftersom is-kristaller bildas, lösning effekter och osmotisk chock verkar orsaka flera cryoinjuries i post-tinade ägg och embryon. Långsam frysning med programmerbar frysar har fördelen av att använda låga koncentrationer av cryoprotectants, som vanligtvis är förknippade med kemiska toxicitet och osmotisk chock, men deras förmåga att undvika is-kristaller bildas vid låga koncentrationer är begränsad. Långsam frysning också inducerar underkylning effekter som måste undvikas med manuell eller automatisk sådd<sup> 4</sup>. I förglasning processen, höga halter av cryoprotectants hämmar bildningen av iskristaller och leda till bildandet av en GLASARTAD förglasat tillstånd där vatten är stelnat, men inte utökas. Men på grund av toxicitet cyroprotectants vid används koncentrationer kan oocyter / embryon endast utsättas för frysskyddsmedel lösningen för en mycket kort tid och i en minsta volym lösning, innan dränka prover direkt i flytande kväve<sup> 5</sup>. Under det senaste decenniet har förglasning blivit mer populärt eftersom det är en mycket snabb metod där ingen dyr utrustning (programmerbara frys) krävs. Fortsätter dock långsam frysning att vara den mest använda metoden för att ägget / embryot frysförvaring. I denna video-artikeln visar vi steg för steg, hur man samlar in och långsamt frysa hamster oocyter med hög post-tina överlevnad. Samma förfarande kan också tillämpas för att lyckas frysa och tina musembryon i olika skeden av preimplantatorisk utveckling.
Protocol
Discussion
Med detta protokoll hamster oocyter och embryon mus kan framgångsrikt frysförvarade. När frysta, kan oocyter / embryon förvaras i flytande kväve tankar på obestämd tid och vid någon tidpunkt återvinnas eller önskad plats. Detta ger fördelen av att ha prov nästan färdig att använda när det behövs. Å andra sidan kan detta protokoll också användas för att generera embryo cryobanks från värdefulla musstammar (t.ex. transgena linjer), som ett ekonomiskt och säkrare alternativ för upprätthållandet av levande djur kolonie…
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av det spanska Ministerio de Educación y Ciencia (BIO 2006 till 11.792) och Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Författarna vill tacka Marc Puigcerver och Jonatan Lucas för tekniskt bistånd vid utarbetandet av media. All personal från Servei d'Estabulari är känd för djurstallar och i synnerhet Juan Jose Martin och Javier Benito för deras ytterligare bidrag för inspelning del av denna video. NCB är en karl i den portugisiska Fundação para en Ciencia e Tecnologia och SG är en karl av den spanska Ministerio de Educación y Ciencia.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U. Cryobiological principles of embryo freezing. J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).
- Vajta, G., Kuwayama, M. Improving cryopreservation systems. Theriogenology. 65, 236-244 (2006).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. JoVE. 3, (2007).
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
